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第一部分风湿性心脏病患者外周血中MMP-12的表达研究[目的]风湿性心脏病(RHD)的发病机制具有炎症的特征,风湿性二尖瓣狭窄(RMVS)是RHD最常见的并发症,RMVS常伴有肺动脉高压(PAH),基质金属蛋白酶(MMPs)参与了 PAH的发病机制;基质金属蛋白酶-12(MMP-12)是MMPs的家族成员之一,常常作为一种炎症介质而参与各种心血管疾病的发生,特定的病理条件下MMP-12在肺内小动脉上持续高表达。据此,本研究拟探讨外周血MMP-12的表达与RMVS的关系。[方法]以50例因RMVS需要接受瓣膜置换术的患者为病例组,另以50例健康人群为对照组。根据二尖瓣狭窄程度将病例组再分为轻中度二尖瓣狭窄组和重度二尖瓣狭窄组。病例组术前和对照组一起采取肘前静脉血分别用于MMP-12的荧光酶学和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测。采用荧光酶学方法检测RHD患者外周血MMP-12的活性,采用ELISA方法检测患者外周血MMP-12的表达水平。统计学分析比较外周血MMP-12的表达和RMVS之间的关系。[结果]在对病例组和对照组的分析中,荧光酶学方法检测结果显示病例组MMP-12的相对荧光单位(RFU)显著高于对照组(1108.57±45.37 vs.1054.98±41.47,P=0.006),ELISA检测结果显示病例组MMP-12的血清浓度显著高于对照组(2.55±1.61ng/ml vs.1.75±0.93,P=0.003)。采用 Logistic 回归分析后结果显示:MMP-12酶活性为RMVS的独立预测因素(P=0.010，OR=1.003,95%CI:1.001-1.006)。在病例组的亚组分析中,荧光酶学方法检测结果显示轻中度RMVS组和重度RMVS组之间MMP-12的RFU比较无统计学差异(1326.06±329.84 vs.1313.82±283.57,P=0.890)。ELISA 检测结果显示重度 RMVS 组MMP-12的血清浓度显著高于轻中度RMVS组(2.09±1.35ng/mlvs.3.08±1/75 ng/ml,P=0.03)。Spearman相关性分析显示:在病例组中,血清MMP-12的表达水平与肺动脉压力呈正相关(r=0.365,P=0.009),与淋巴细胞计数(LYM)呈负相关(r=-0.340,P=0.016)。[结论]MMP-12在RMVS患者外周血中的活性和表达水平升高。外周血MMP-12可以作为RMVS的辅助诊断指标以及二尖瓣狭窄程度的预测指标。肺动脉高压(PASP)是RMVS患者血清MMP-12水平升高的重要影响因素。通过荧光酶学和ELISA检测外周血MMP-12的活性和表达可以作为RMVS的辅助诊断方法。第二部分 风湿性心脏病患者二尖瓣组织中MMP-12的表达研究[目的]钙化是风湿性瓣膜病变中常见的一种退行性改变,基质金属蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12,MMP-12)与瓣膜的钙化密切相关。为此,本研究拟探讨MMP-12在风湿性二尖瓣膜组织中的表达以及与二尖瓣狭窄程度的关系。[方法]以24例风湿性二尖瓣狭窄(rheumatic mitral valve stenosis,RMVS)瓣膜为病例组,以3例非风湿性二尖瓣膜为对照组。采用HE染色观察二尖瓣组织的病理变化,根据免疫组化染色观察MMP-12在二尖瓣组织中的表达,利用RT-PCR的方法研究MMP-12 mRNA在二尖瓣组织中的表达情况,应用Western blottting的方法研究MMP-12蛋白在二尖瓣组织中的定量表达情况。[结果]HE染色显示正常二尖瓣组织遭到破坏,由纤维素增生、毛细血管增生以及炎性细胞浸润所取代。RMVS典型的退行性病变,如钙化、粘液性变性和胶原纤维透明样变性等存在于病变的二尖瓣组织中。通过免疫组化染色显示在风湿性和非风湿性二尖瓣组织中都存在MMP-12的表达,MMP-12表达于瓣膜血管内皮细胞(VEC)的胞浆中。通过RT-PCR,我们进一步在基因水平上证实了MMP-12 mRNA表达于风湿性和非风湿性二尖瓣组织中。采用Western blotting的方法,我们进一步从蛋白水平证实了 MMP-12蛋白表达于风湿性和非风湿性二尖瓣组织中,并且通过定量分析发现,MMP-12蛋白在风湿性二尖瓣组织中的表达水平要高于非风湿性的二尖瓣组织(P<0.001);在重度狭窄的风湿性二尖瓣组织MMP-12的表达水平明显高于中度和轻度狭窄的风湿性二尖瓣组织(P<0.001)。[结论]MMP-12表达于风湿性和非风湿性的二尖瓣组织中。MMP-12的表达水平和二尖瓣的狭窄程度相关,MMP-12可能参与了风湿性二尖瓣组织的重构。第三部分MMP-1、-3和-12启动子区多态性与风湿性心脏病的相关性分析[目的]风湿性心脏病(RHD)的发病与遗传易感性相关。基质金属蛋白酶-1、-3和-12(MMP-1,-3和-12)共同定位于同一染色体,MMP-1,-3和-12基因启动子区在功能上有协同作用,研究表明MMP-1,-3和-12基因启动子区多态性参与了心血管疾病的发病机制。本研究拟探讨MMP-1,-3和-12启动子区多态性与RHD之间的相关性。[方法]以90例RHD患者和90例健康志愿者为研究对象,将RHD患者作为病例组,健康志愿者作为对照组。从外周血标本中提取DNA,针对位于启动子区的MMP-1-1607、MMP-3-1612、MMP-12-82位点采用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增,扩增后的PCR产物进行直接测序,测序后判断为杂合子的基因型采用克隆测序的方法进一步验证。运用非条件logistic回归模型和卡方检验比较基质金属蛋白酶(MMPs)启动子区多态性基因型和等位基因频率分布的差异。[结果]MMP-1-1607整体基因型分布频率在病例组和对照组中无显著统计学差异(P=0.072);与1G/1G的基因型分布频率相比,2G/2G的基因型分布频率在病例组中要显著高于对照组(45.6%vs.34.4%;p=0.03;OR=3.227,95%CI:1.118-9.31),而1G/2G的基因型分布频率在病例组和对照组中无显著统计学差异(47.8%vs，48.9%;p=0.09;OR=2.455,95%CI:0.87-6.926);与 1G 等位基因分布频率相比,2G等位基因分布频率在病例组中显著高于对照组(69.4%vs.58.9%;p=0.048;OR=0.644,95%CI:0.416-0.996)。MMP-3-1612 整体基因型分布频率在病例组和对照组中无显著统计学差异(P=0.509);与6A/6A的基因型分布频率相比,5A/6A的基因型分布频率在病例组和对照组中无统计学差异(23.3%vs.24.4%;P=0.973;OR=0.993,95%CI:0.498-1.981),5A/5A的基因型分布频率在病例组和对照组中无统计学差异(4.4%vs.1.1%;p=0.230;OR=3.908,95%CI:0.421-36.242);与6A等位基因分布频率相比,5A等位基因分布频率在病例组和对照组中无统计学差异(16.1%vs.13.3%;P=0.473;OR=1.24,95%CI:0.689-2.231)。MMP-12-82整体基因型分布频率在病例组和对照组中无显著统计学差异(P=0.767);与A/A的基因型分布频率相比,A/G的基因型分布频率在病例组和对照组中无统计学差异(5.6%vs.7.8%;P=0.59;OR=0.708,95%CI:0.215-2.324);与A等位基因分布频率相比,G等位基因分布频率在病例组和对照组中无统计学差异(2.8%vs.3.9%;P=0.576;OR=0.717,95%CI:0.223-2.307)。另外,在MMP-12基因启动子上游信号肽序列(rs191825816)发现了胞嘧啶(C)→胸腺嘧啶(T)的错义突变。该位点的错义突变仅出现在两例RHD患者中(2.2%),而对照组中没有发现该位点的突变。MMP-12基因(rs191825816)整体基因型分布频率在病例组和对照组中无显著统计学差异(P=0.497)。与C/C的基因型分布频率相比,C/T的基因型分布频率在病例组和对照组中无统计学差异(P=0.497;OR=0.978,95%CI:0.948-1.009);与C等位基因分布频率相比,T等位基因分布频率在病例组和对照组中无统计学差异(P=0.499;OR=0.989,95%CI:0.974-1.004)。[结论]MMP-1-1607 1G/2G多态性与RHD的发病相关联,2G等位基因可能是RHD发病的遗传易感基因;MMP-12基因信号肽(rs191825816)多态性存在于RHD患者中。通过克隆测序的方法针对杂合子进行验证,结果更加准确。