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1目的观察VEGF血管生成信号通路下游的Ras、MAPK、PI3K、AKT蛋白在复发性流产小鼠及肾虚型复发性流产患者蜕膜组织中的表达,通过对复发性流产小鼠进行干预,探索补肾安胎冲剂对其表达的影响,及补肾健脾中药促进母胎界面血管生成的分子生物学机制,为补肾健脾中药应用于临床保胎提供理论依据。2方法临床收集2018年全年就诊于安徽中医药大学第一附属医院妇科门诊及住院的肾虚型复发性流产患者30例作为观察组;同一时期的正常早期妊娠要求行人工流产患者30例作为对照组。获取蜕膜组织,采用HE染色分析比较两组患者蜕膜组织形态变化及免疫组化S-P法检测两组蜕膜组织中Ras、MAPK、PI3K、AKT的蛋白表达情况,并对检测结果进行统计学分析。实验采用DBA/2×CBA/J的Clark经典反复流产模型小鼠50只,按妊娠顺序随机分为RSA模型组、西药对照组、中药高、中、低剂量组,每组10只,及BALB/c×CBA/J正常妊娠小鼠10只,从妊娠第一天始,分别给予不同干预方式15天,末次给药24小时后,处死小鼠,摘取子宫,观察6组小鼠胚胎丢失情况,剥离蜕膜,采用HE染色分析比较各组小鼠的蜕膜组织形态,及免疫组化方法、Western-blot技术对6组小鼠的蜕膜组织相关Ras、MAPK、PI3K、AKT蛋白表达情况予以检测和分析,并对检测数据进行统计分析。3结果临床研究结果3.1观察HE染色两组患者蜕膜组织形态变化与对照组相比,镜下见观察组患者蜕膜组织细胞数量明显减少,排列紊乱,大小极不规则,部分细胞被挤压变形,腺体萎缩,细胞核变小,部分为梭形,染色明显加深,呈固缩状,甚则核消失,胞浆水肿,呈空泡变,细胞间质呈纤维素样改变,血管数量减少,血管内壁可见瘀血附着。3.2比较免疫组化法测定两组患者蜕膜组织相关蛋白的表达情况3.2.1 Ras、MAPK在两组患者蜕膜组织中的表达情况Ras、MAPK蛋白主要表达于两组患者的腺上皮细胞和血管内皮细胞胞浆中。与对照组相比,观察组患者蜕膜组织中的Ras、MAPK蛋白表达含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.2.2 PI3K、AKT在两组患者蜕膜组织中的表达情况PI3K、AKT蛋白主要是在两组患者的腺上皮细胞以及血管内皮细胞的胞浆内表达,而在胞膜上也存在少量表达。且观察组相关蛋白表达低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验研究结果3.1比较各组小鼠胚胎丢失率与正常组比较,模型组小鼠胚胎丢失率显著提高(P<0.01)。与模型组相比,西药组、中药高、中剂量组小鼠胚胎丢失率显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01),中药低剂量组胚胎丢失率低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。与西药组相比,中药高剂量组疗效较好,RSA小鼠胚胎丢失率与其接近(P>0.05)。与中药高剂量组相比,中药中、低剂量组小鼠胚胎丢失率明显降低(P<0.01)。3.2比较HE染色各组小鼠蜕膜组织形态变化和正常组对比,模型组小鼠蜕膜组织变性,蜕膜细胞数量明显减少,细胞排列紊乱,胞浆水肿明显,呈空泡变,部分核消失,细胞核固缩,染色加深,血管数量明显减少。和模型组相比,西药组及中药各剂量组小鼠蜕膜组织内细胞数量及血管数量均增多,西药组与中药高剂量组的蜕膜组织形态,未见明显区别。随着中药剂量的增大,蜕膜组织细胞数量及血管数量逐渐增多,胞质逐渐丰富,胞浆水肿缓解,核仁逐渐淡染,变大且明显,管壁渐趋完整,血管内皮细胞排列整齐。3.3分析免疫组化法测定各组小鼠蜕膜组织相关蛋白的表达情况3.3.1免疫组化法测定各组小鼠蜕膜Ras、MAPK蛋白的表达情况Ras、MAPK蛋白主要分布于小鼠的腺上皮细胞以及血管内皮细胞的胞浆内,在细胞核及膜上未见明显表达。与正常组相比,模型组Ras、MAPK蛋白表达含量显著下降(P<0.01)。与模型组相比,西药组、中药高、中、低剂量组Ras、MAPK蛋白表达含量显著升高(P<0.01)。与中药高剂量组相比,中药中、低剂量组Ras、MAPK蛋白表达含量显著下降(P<0.01);西药组Ras、MAPK蛋白表达含量下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.3.2免疫组化法测定各组小鼠蜕膜PI3K、AKT蛋白的表达情况PI3K、AKT蛋白主要分布于小鼠的腺上皮细胞以及血管内皮细胞的胞浆内,在胞膜上亦可见少量表达。和正常组小鼠对比,模型组小鼠的PI3K、AKT蛋白表达含量显著降低(P<0.01);与模型组相比,西药组、中药高、中、低剂量组PI3K、AKT蛋白表达含量显著升高(P<0.01)。与西药组相比,中药高剂量组PI3K、AKT蛋白表达量未见明显差异(P>0.05)。与中药高剂量组相比,中药中、低剂量组PI3K、AKT蛋白表达量较明显降低(P<0.01)。3.4比较采取Western blot测定各组小鼠的蜕膜组织相关蛋白的表达情况3.4.1比较采取Western blot测定各组小鼠的蜕膜组织Ras、MAPK蛋白的表达情况与正常组相比,模型组Ras、MAPK蛋白表达含量显著下降(P<0.01)。与模型组相比,西药组、中药高、中、低剂量组Ras、MAPK蛋白表达含量显著升高(P<0.01)。与中药高剂量组相比,中药中、低剂量组Ras、MAPK蛋白表达含量显著下降(P<0.01);西药组Ras、MAPK蛋白表达含量下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.4.2比较采取Western blot测定各组小鼠的蜕膜组织PI3K、AKT蛋白的表达情况和正常组小鼠对比,模型组小鼠的蜕膜相关PI3K、AKT表达情况明显减少(P<0.01);和模型组小鼠对比,西药组小鼠、中药高剂量组小鼠、中药中剂量组小鼠、中药低剂量组小鼠的蜕膜PI3K、AKT表达情况明显提升(P<0.01);与西药组相比,中药高剂量组蜕膜PI3K、AKT表达未见明显差异(P>0.05);与中药高剂量组相比,中药中、低剂量组蜕膜组织PI3K、AKT表达显著降低(P<0.01)。4结论4.1 RSA患者及小鼠蜕膜组织形态存在明显变异,且母胎界面血管发育不良,血供差。蜕膜血管生成与Ras、MAPK、PI3K、AKT相关蛋白的表达有关。4.2以补肾健脾中药组方的补肾安胎冲剂可明显改善RSA小鼠蜕膜组织形态,促进其蜕膜血管的新生,降低RSA小鼠胚胎丢失率,从而达到保护妊娠的作用。4.3补肾安胎冲剂保护妊娠的可能机制:(1)补肾安胎冲剂通过上调RSA小鼠蜕膜组织血管生成信号通路中Ras、MAPK、PI3K、AKT蛋白的表达,且随着中药剂量的增加,其蛋白表达水平逐渐增强,从而促进蜕膜血管新生,改善蜕膜组织血供,保证母胎界面血流通畅和对胚胎营养的供应,进而降低胚胎丢失率。(2)补肾安胎冲剂通过改善蜕膜血管生成通路中Ras、MAPK、PI3K、AKT蛋白的表达水平,促进VEGF/Ras/MAPK和VEGF/PI3K/AKT通路上的信号传递,保障通路中各信号分子的协调工作,从而改善蜕膜血管新生,促进RSA小鼠胚胎发育。