褐飞虱Nilaparvata lugens(Stal)是我国及亚洲其他国家水稻的重要害虫,具有迁飞性、易暴发性、集群性等特点。单吸食水稻汁液、产卵和传播病毒等行为,对我国水稻生产造成严重危害。化学农药的长期使用使褐飞虱产生较强的抗药性及再猖獗现象。目前,抗性水稻品种的推广种植是防治褐飞虱主要方式之一,随着褐飞虱产生新的致害性,抗性水稻品种的抗性也逐渐丧失。褐飞虱致害性的变异与体内共生的类酵母共生菌(yeast-like symbionts,YLSs)相关。类酵母共生菌,聚集在腹部脂肪体细胞中,通过经卵垂直传播的方式在褐飞虱代次间进行传播,在褐飞虱生长发育过程中起着重要作用,也为防治褐飞虱提供了新的方向。本研究克隆得到褐飞虱两个吞蛋白基因(endophilin):endophilin A和endophilinB,并通过生物信息学分析、表达特性分析及RNA干扰等方面研究了这两个吞蛋白基因在褐飞虱卵巢发育和类酵母共生菌入侵褐飞虱卵巢中的作用。研究结果如下:一、褐飞虱Endophilin A、Endophilin B基因序列分析克隆得到褐飞虱两个endophilin基因(以下简称Endo):Endo(GenBank登录号:KY126096)和 Endo B(GenBank 登录号:KY126095)。Endo A 的 cDNA 序列含有一个完整1164 bp的开放阅读框,编码387个氨基酸,预测分子量为43.075 kDa;Endo B的cDNA序列含有一个完整1059 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸,预测分子量为39.003 kDa。通过氨基酸比对及进化树分析,Endo A和Endo B在昆虫中相对保守。对Endo A和Endo B的二级及三级结构进行预测,两个蛋白均包括BAR结构域及SH3结构域,但在BAR结构域上存在较大差异,说明二者在功能上可能存在差别。二、Endo A和Endo B基因的表达特性通过荧光定量PCR分析Endo A E和dnB基因在褐飞虱不同发育阶段及各组织中表达情况。结果表明,Endo A和Endo B在褐飞虱不同发育阶段均有表达。Endo A在褐飞虱1～5龄若虫表达量相对稳定,在成虫中表达量呈增长趋势;Endo B在褐飞虱1～5龄若虫及成虫中表达量呈相对稳定状态。在检测的褐飞虱组织中,End A和Endo B均在褐飞虱卵巢中表达量最高。三、Endo A和Endo B的原核表达、多克隆抗体的制备及表达定位成功构建了吞蛋白的原核表达体系,并纯化融合蛋白用于制备多克隆抗体。用ELISA测得Endo A和Endo B的多抗效价都可达1:1000000。Western blot检测显示Endo A多抗和Endo B多抗特异性良好。免疫荧光结果显示,褐飞虱的Endo A和Endo B在卵巢中广泛表达,并且二者的分布与脂类物质的相似,此外,这两个蛋白还与正在入侵褐飞虱卵巢的类酵母共生菌共定位。这些结果说明,Endo A和Endo B不仅与褐飞虱卵巢吸收脂类物质和卵巢成熟有关,而且还与类酵母共生菌入侵褐飞虱卵巢有一定的关联。四、Endo A和Endo B基因的RNAi研究体外转录分别合成了 dsEndo A和dsEndo B 注射褐飞虱5龄后期若虫。RNA干扰后,Endo A和Endo B在转录水平上有显著的下调,卵巢滤泡细胞中的Endo A和Endo B蛋白表达量也相应减少。RNA干扰后,羽化后3天褐飞虱的卵巢发育相较于对照延迟,而类酵母共生菌基本没有进入RNA干扰后的卵巢。这些结果,充分验证了 Endo A和Endo B对褐飞虱卵巢发育和类酵母共生菌入侵卵巢的重要作用。