目的血小板减少症(thrombocytopenia, TCP)是脓毒症的严重并发症之一,常会增加患者的出血倾向。同时它也是脓毒症严重程度的评价指标及判断脓毒症患者预后的预测指标。但脓毒症合并TCP的发生机制并未完全明确。已有的研究结果表明,脓毒症时TCP的发生是多因素的,可能涉及到炎症反应、凝血系统及免疫反应。用大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)攻击小鼠可诱导出快速的TCP,但这种TCP的发生是LPS介导的炎症反应或凝血系统过度活化所致,还是LPS与血小板Toll样受体4相互作用后直接引起的血小板破坏所致仍不明确。因此,我们通过建立单次腹腔注射不同剂量LPS诱导小鼠TCP模型,观察LPS诱导的快速TCP的变化趋势、检测血浆炎症反应及凝血系统活化的标志物水平以及LPS对分离血小板凋亡指标的影响,进而判断TCP与LPS诱导快速TCP时机体的炎症反应和凝血系统状态的关系,及LPS与血小板直接作用引起的血小板生存状态的改变在TCP发生中的作用。内容1、单次腹腔注射LPS诱导小鼠TCP模型的建立及评价。2、LPS诱导小鼠TCP时机体炎症反应和凝血状态,及与TCP发生的关系的研究。3、体外条件下,LPS诱导血小板凋亡的研究。方法第一部分：建立单次腹腔注射LPS诱导小鼠TCP模型,观察不同剂量LPS腹腔注射后不同时间点小鼠PLT、MPV及PDW的变化,并观察各组动物的死亡率第二部分：经腹腔注射非致死剂量(0.5mg/kg)和致死剂量(50mg/kg) LPS,于给药后4h和24h采集标本,应用ELISA方法检测血浆IL-6、TNF-α、TAT、 FDP、D-Dimer和TPO浓度,观察肺组织病理形态学改变,应用real-time PCR测定肾TPO mRNA表达量。第三部分：制备洗涤血小板,室温条件下与LPS共同孵育3Omin,应用化学发光法测定ATP水平和Caspase-3活性,应用流式细胞技术测定PS外翻和AΨm去极化,应用Western Blot测定Caspase-8、-9、 ak、Bax和 Bcl-2的表达。结果第一部分：单次腹腔注射LPS,可稳定地诱导小鼠TCP的发生,TCP的程度取决于LPS的剂量。根据对死亡率的影响,将LPS剂量分为非致死剂量(0.05mg/kg-5mg/kg)和致死剂量(50mg/kg)。非致死剂量各组随LPS剂量不同,PLT组间差异有统计学意义,而MPV和PDW组间差异无统计学意义。而对24h内所有LPS剂量组,包括致死剂量组进行分析发现,PLT、MPV和PDW在不同处理组之间差异均有统计学意义。第二部分：与对照组比较IL-6和TNF-α在不同剂量LPS处理组均明显下降,而不同剂量LPS组之间差异无统计学意义,这表明在指定的观察时点小鼠机体并非处于过度炎症反应状态,且在相同时点不同剂量LPS处理组动物的炎症反应状态无差异。与对照组比较TAT水平在LPS处理组明显下降,而不同剂量LPS处理组间无差异,这表明,虽然LPS可引起TAT的明显下降,但在不同剂量LPS处理组之间,凝血酶活化状态没有差别。同对照组比较,LPS处理组D-Dimer和FDP浓度无明显变化,且不同剂量LPS处理组之间无差异,这表明,小鼠凝血系统并未发生过度活化及纤溶亢进。血浆TPO浓度及肾TPOmRNA表达水平组间无差异,表明在本实验条件下,机体并未通过增加TPO的表达发挥代偿作用。第三部分：以对照组为阴性对照,以凝血酶为阳性对照观察LPS与血小板孵育后,可引起血小板总ATP量升高、PS外翻、△Ψm去极化、Caspase-3活性增高、Caspase-8、-9、 Bak、Bax和Bcl-2的表达增高。结论第一部分：单次腹腔注射LPS可诱导稳定的小鼠TCP模型,TCP程度及持续时间与LPS呈剂量依赖性。同时,机体可启动快速的代偿性机制增加血小板的生成。第二部分：单次腹腔注射LPS诱导TCP并不伴有炎症反应和凝血系统活化过度状态,这提示LPS可通过不依赖于炎症反应和凝血系统过度活化的途径诱导TCP。机体的快速代偿性血小板释放反应是通过非TPO依赖的途径介导的。第三部分：体外条件下,LPS可诱导血小板发生以AΨm去极化、Caspase-3活性增高、Caspase-8、-9、Bak、 Bax口Bcl-2的表达增高为特点的凋亡性改变,这种凋亡性改变可能继发于LPS的血小板过度活化。