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背景与目的:黑色素瘤是比较常见的皮肤软组织恶性肿瘤,近年来发病率不断升高。黑色素瘤恶性程度很高,转移早,预后差。尽管黑色素瘤的免疫治疗、靶向治疗等均取得了一些进展,但仍存在部分患者无效、肿瘤细胞耐药、费用高等问题,因此继续探索其他的治疗方案仍然十分必要。淋巴管转移是黑色素瘤主要转移方式,肿瘤周围及瘤体内淋巴管的形成是肿瘤经淋巴管转移的前提。因此,通过抑制肿瘤周围及瘤体内的淋巴管形成,减少肿瘤周围和瘤体内的淋巴管数量,理论上可以推迟、延缓肿瘤经淋巴管转移,从而延长患者的生存时间。雷帕霉素(又称为西罗莫司)作为哺乳动物雷帕霉素靶分子(Mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂,最初被用作抗肾移植术后的免疫排斥反应。由于mTOR信号通路的作用广泛,关于雷帕霉素的其他作用也不断地被发现,其中就包括了抗脉管形成作用。体内、体外实验证实能抑制正常淋巴管形成和某些肿瘤内的淋巴管形成。因此,我们设想雷帕霉素也可能抑制黑色素瘤瘤体及其周围的淋巴管形成,从而成为治疗黑色素的有效药物。本研究通过建立黑色素瘤的裸鼠移植瘤模型,并应用模型进行雷帕霉素干预,观察移植瘤周围和瘤体中的淋巴管形成是否受到影响,并探讨其影响机制。本研究的目的是为应用雷帕霉素治疗黑色素瘤提供实验依据。方法:(1)实验分组:体外培养扩增A375人黑色素瘤细胞,将细胞注入裸鼠背部两侧皮下建立移植瘤模型,2周后形成瘤体。以腹腔注射生理盐水(NS组)和雷帕霉素分别作为正常对照组和雷帕霉素干预组。干预2周后分别取出裸鼠背部两侧的移植瘤标本。所有标本分为两部分,一部分用4%甲醛固定、石蜡包埋,用于后续的H-E染色、常规免疫组化和免疫荧光染色等;另一部分置于液氮中保存,用于后续的PCR和Western-blot等检测。(2)常规免疫组化、免疫荧光染色观察移植瘤瘤周及瘤体内淋巴管及其数量的变化。(3)免疫组化染色观察移植瘤中mTORCl/p70S6K/4EBP1的表达,并行Western Blot检测mTORCI/p70S6K/p-p70S6K/4EBP1/P-4EBP1及淋巴管形成相关因子和受体VEGF-C/VEGFR-3的表达。(4)实时定量PCR检测移植瘤中淋巴管形成相关基因VEGF-C/VEGFR-3的表达。结果:(1)H-E染色见移植瘤为典型的黑色素瘤样病理结构。常规免疫组化和免疫荧光染色显示移植瘤瘤周及瘤体内均可见LYVE-1(+)淋巴管。(2)免疫组化染色显示雷帕霉素组移植瘤瘤周及瘤体内平均淋巴管密度显著低于生理盐水对照组。(3)免疫组化染色及Western Blot检测提示雷帕霉素组移植瘤内非磷酸化mTOR/p70S6K/4EBP1蛋白水平与生理盐水对照组相比无明显差异,p-p70S6K/p-4EBP1蛋白水平显著低于生理盐水对照组。(4)Western Blot检测以及实时定量PCR检测显示雷帕霉素组移植瘤中VEGF-C/VEGFR-3蛋白及基因表达均明显低于生理盐水对照组。结论:雷帕霉素能抑制黑色素瘤的裸鼠移植瘤瘤周以及瘤体内的淋巴管形成,降低移植瘤瘤周以及瘤体内的淋巴管密度。其可能机制是阻断mTOR信号通路,进一步抑制VEGF-C/VEGFR-3的表达,从而抑制淋巴管形成。本研究结果可作为应用雷帕霉素治疗黑色素瘤的初步实验依据。