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[研究背景]血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）家族是目前研究较深入的血管生长因子家族，已经发现的成员包括VEGF-A、PlGF（placenta growthfactor，胎盘生长因子）、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E。VEGF-A，又称VEGF，是其中最主要的成员。VEGF在基因转录过程中由于不同的剪接方式形成几种分子量不同的VEGF同种异构体，在人类主要为VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206等。表皮角质形成细胞是VEGF的主要分泌细胞之一，在某些炎症性皮肤病如银屑病、特应性皮炎等情况下，皮肤角质形成细胞分泌VEGF明显增加，通过旁分泌作用促进真皮层微血管增生。角质形成细胞主要分泌VEGF的两种同种异构体：VEGF121和VEGF165，其中VEGF165效应性最强。VEGF家族成员通过血管内皮细胞特异性的VEGF受体（VEGF receptor，VEGFR）介导内皮细胞增殖、微血管增生及增强血管通透性。目前已经发现的VEGF受体家族可分为两大类：酪氨酸激酶受体和非酪氨酸激酶受体，其中前者包括VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，后者包括neuropilin-1（NRP-1），neuropilin-2（NRP-2）。VEGF对内皮细胞的促增殖、分化作用主要是由VEGFR-2介导的。近年来，越来越多的研究发现VEGFR家族不仅表达在血管内皮细胞上，而且在一些非血管内皮细胞上也有表达，包括某些肿瘤细胞、造血干细胞、神经元细胞、血管平滑肌细胞、视网膜上皮细胞、黑素细胞等。我们实验室曾经用免疫组化的方法发现在正常人的皮肤角质形成细胞、毛囊细胞及皮脂腺细胞均有VEGFR-1、VEGFR-2的表达，而在银屑病的角质形成细胞表达VEGFR-1、VEGFR-2更明显。而Wilgus等用免疫组化的方法发现在小鼠及正常人的角质形成细胞有VEGFR-1表达，而没有检测到VEGFR-2的表达。Kurschat等在HaCaT细胞中检测不到VEGFR-1和VEGFR-2的表达。证实VEGF受体在角质形成细胞中的表达情况有助于进一步研究VEGF受体在角质形成细胞中表达的生物学意义。[目的]明确VEGF受体在角质形成细胞中的表达情况，研究角质形成细胞分泌的VEGF除以旁分泌的形式发挥作用之外，是否还可以通过作用于角质形成细胞自身表达的VEGF受体介导自分泌作用，介导细胞增殖、迁移及粘附。重点研究VEGFR-2在角质形成细胞VEGF自分泌作用中是否起了主要的作用。同时研究他克莫司对HaCaT细胞增殖及VEGF／VEGFR-2表达的影响。[方法]第一部分：培养HaCaT细胞，提取总RNA和蛋白质。以逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）检测HaCaT细胞VEGF受体mRNA的表达水平；以Western-blot法检测HaCaT细胞VEGFR蛋白质的表达水平；以间接免疫荧光法对VEGF受体在HaCaT细胞中的表达进行定位。第二部分：使用外源性VEGF165作为刺激因子刺激HaCaT细胞，同时使用VEGF的中和性单克隆抗体bevacizumab（Avastine）抑制内源性VEGF，观察不同浓度VEGF165和bevacizumab（Avastine）作用下HaCaT细胞增殖、粘附和迁移能力的变化。以10ng/ml VEGF165刺激血清饥饿的HaCaT细胞，观察其对VEGFR-2、PLC-γ1、ERK1／2磷酸化的促进作用，探讨VEGF调节细胞活性的细胞内信号传导途径。另外我们使用VEGFR-2的中和性抗体MAB3571预处理HaCaT细胞，以进一步了解VEGFR-2在角质形成细胞VEGF自分泌作用的过程中是否起了重要作用。最后我们使用bevacizumab和MAB3571抑制／阻断内源性VEGF的作用，探讨VEGF拮抗HaCaT细胞凋亡的作用。第三部分：观察不同浓度他克莫司作用下HaCaT细胞VEGF及其受体VEGFR-2表达的改变，另外我们还观察了外源性10ng／ml VEGF165是否能逆转不同浓度他克莫司对HaCaT细胞增殖的抑制作用。[结果]一、VEGF受体在HaCaT细胞中的表达：1)RT-PCR：HaCaT细胞表达VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和neuropilin-1（NRP-1）、neuropilin-2（NRP-2）的mRNA；2)Western-blot：HaCaT细胞在蛋白质水平表达VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和NRP-1、NRP-2。3)间接免疫荧光：VEGFR家族成员VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和NRP-1、NRP-2荧光信号定位于细胞膜，少部分位于细胞质内；二、VEGF165剂量依赖性地促进HaCaT细胞的增殖，而bevacizumab则呈剂量依赖性地抑制HaCaT细胞的增殖。三、VEGFR-2中和性抗体MAB3571能够拮抗10ng／ml VEGF165对HaCaT细胞增殖的促进作用。四、VEGF165剂量依赖性地促进HaCaT细胞的迁移能力，而bevacizumab剂量依赖性地抑制HaCaT细胞的迁移能力。五、VEGFR-2中和性抗体MAB3571能够拮抗10ng／ml VEGF165对HaCaT细胞迁移能力的促进作用。六、VEGF165剂量依赖性地抑制HaCaT细胞的粘附能力，而bevacizumab剂量依赖性地促进HaCaT细胞的粘附能力。七、VEGFR-2中和性抗体MAB3571能够拮抗10ng／ml VEGF165对HaCaT细胞粘附的抑制作用。八、VEGF165促进HaCaT细胞VEGFR-2、PLC-γ1、ERK1／2的磷酸化，VEGFR-2中和性抗体MAB3571能够拮抗VEGF165对HaCaT细胞VEGFR-2、PLC-γ1、ERK1／2的磷酸化作用。九、使用bevacizumab或者MAB3571抑制／阻断内源性VEGF的作用后，HaCaT细胞出现明显的凋亡。十、低浓度VEGF165呈剂量依赖性地促进HaCaT细胞VEGFR-2 mRNA和蛋白质的表达。十一、他克莫司剂量依赖性下调VEGF和VEGFR-2 mRNA表达和蛋白质表达。十二、他克莫司剂量依赖性抑制HaCaT细胞增殖，VEGF165部分逆转他克莫司对HaCaT细胞增殖的抑制作用。[结论]一、角质形成细胞细胞系HaCaT细胞在mRNA和蛋白质水平上均表达VEGFR家族成员VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和NRP-1、NRP-2。二、角质形成细胞分泌的VEGF，除以旁分泌的形式发挥作用之外，还可以通过作用于角质形成细胞自身表达的VEGF受体发挥自分泌作用，从而介导其细胞活性，此即VEGF的自分泌作用。VEGFR-2在介导角质形成细胞VEGF自分泌作用过程中发挥重要作用。三、在HaCaT细胞中，VEGF发挥生物学效应的途径之一是通过VEGFR-2／PLC-γ1／MAPK信号传导通路促进细胞的增殖和迁移。四、他克莫司部分通过抑制VEGF／VEGFR-2的自分泌作用，发挥对角质形成细胞的增殖抑制作用。