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研究背景全蝎具有祛风止痉的作用,为历代中医用来治疗惊厥、癫痫的首选药物,全蝎的药效在于蝎尾中的毒液组分,国内多位学者以全蝎粗毒治疗癫痫大鼠,取得了满意的效果。蝎尾中的抗癫痫有效成分为抗癫痫肽(anti-epilepsy peptide, AEP),该成分已经由国内学者成功分离并测序,经癫痫大鼠模型验证了其活性,疗效确切。腺相关病毒(AAV)载体可将外源基因导入动物或人体内,且无对机体的致病性。本课题组王宗仁教授等已成功地由东亚全蝎蝎尾毒腺中获取了AEP基因序列,并将该序列克隆入AAV载体,构建了重组抗癫痫肽腺伴随病毒(rAAV/AEP)载体,此工作为癫痫的基因治疗提供了新的可能。但AEP为相对分子量8.3kDa的多肽,目前尚无简便可靠的相关检测手段,AEP的抗体研究也未有报道。如果能够成功制备AEP相关抗体,我们就可以获得一种特异有效的检测AEP的方法,从而,可以进一步验证rAAV/AEP的表达情况,为进一步的rAAV/AEP有效性研究打下实验基础。实验方法1构建融合表达载体,进行蛋白表:从克隆载体质粒pGEM-T/AEP中双酶切,得到AEP片段;通过中间载体puc18,转换多克隆位点;最后将AEP基因克隆入表达载体pGEX-4T-1质粒中,构建融合表达载体pGEX-4T-1/AEP;转化感受态大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得GST-AEP融合蛋白;SDS-PAGE分析表达产物,确定蛋白质高表达条件。2蛋白可溶性分析,纯化,定量:超声裂解法及SDS-PAGE鉴定蛋白可容性,融合蛋白包涵体经过洗涤、变性、复性后,通过12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,再次进行可溶性分析,凝胶薄层扫描检测其纯度,透析管进一步纯化蛋白,BCA法蛋白定量。3制备融合蛋白的多克隆抗体: IPTG诱导重组大肠杆菌DH5α表达GST-AEP融合蛋白,以融合蛋白免疫家兔,获得GST-AEP多克隆抗体,western-blot法进行抗体鉴定,ELISA法测定抗体效价,western-blot检定多抗敏感度。4检测rAAV/AEP的表达:以rAAV/AEP感染293细胞,蛋白浓缩后,western-blot检测无血清培养基上清中的AEP表达情况;以rAAV/AEP肌肉注射方式进行大鼠活体给药,第21天采血,第29天采血及注射点组织,western-blot检测血清中AEP的表达,RT-PCR检测AEP序列整合情况。实验结果成功构建了融合蛋白表达载体pGEX-4T-1/AEP,确定了蛋白高表达条件为37℃,5h,IPTG终浓度为4mmol/L;所获取的融合蛋白以包涵体形式存在,经尿素变性再复性后蛋白可溶,进一步纯化,定量约0.163μg/μl;以含有融合蛋白的凝胶悬液免疫家兔后,成功获得了多克隆抗体,抗体效价为1:12000,检测敏感度为0.065μg;western-blot法可以检测到无血清培养基上清中存在AEP,注射点组织RT-PCR证实AEP序列已成功整合入大鼠肌细胞的基因组中,但于大鼠血清中未检测到AEP的表达。结论本研究以原核表达的方式,获得了融合表达的GST-AEP,成功制备和鉴定了相关多克隆抗体,初步证实了rAAV/AEP的表达活性。在动物整体未能检测到AEP的表达,可能与分泌入血清中的AEP浓度较低有关。