固定化季也蒙毕赤酵母SC1103细胞催化生物基呋喃选择性还原的研究

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5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,HMF)及糠醛是重要的生物基平台化合物,可以通过碳水化合物脱水制备得到。HMF及糠醛中均含有醛基,选择性还原可分别合成2,5-二羟基呋喃(2,5-bis(hydroxymethyl)furan,BHMF)及糠醇。BHMF及糠醇是合成功能材料、药物、冠醚、农业化学品、合成纤维等的重要中间体。目前,化学法是制备BHMF及糠醇的主要途径,但存在反应条件苛刻、环境污染严重、能耗高等问题;并且激烈的反应条件易促使不稳定的糠醛类化合物形成大量副产物,从而导致选择性不理想。生物催化具有高效、高选择性、反应条件温和、简单、环境友好等优点,有望补充或取代化学方法用于合成BHMF及糠醇。然而生物催化HMF及糠醛转化仍颇具挑战,因为这两种底物对微生物细胞具有强烈的抑制和毒性作用。最近,本课题组报道了一株可耐受一定浓度HMF、且能合成BHMF的季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii SC1103。但由于反应过程中使用游离野生型细胞作为催化剂,一方面不便于生物催化剂的重复利用,另一方面底物耐受性仍较差,导致生产效率不理想。基于上述情况,本论文首先对酵母菌株的生理生化特性进行研究。随后,采用驯化与诱导相结合的方法极大地改善了野生型季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii SC1103的催化性能。为了提高生产效率,将驯化细胞高密度固定在生物相容性海藻酸钙小球中,考察了固定化细胞的催化特性并研究了各关键因素对固定化细胞选择性还原HMF的影响,建立了高效、高选择性合成BHMF的生物催化途径。此外,对BHMF合成工艺进行放大研究,并对产物进行了分离纯化以验证该生物催化方法的实用性。尝试采用廉价的水稻秸秆水解液取代辅底物葡萄糖,为开发经济性的生物催化工艺奠定了基础。最后,对建立的高效生物催化途径的普适性进行了研究,并应用于糠醇合成。结果表明,该菌会优先利用葡萄糖、果糖、半乳糖等单糖作为碳源;最易利用蛋白胨、牛肉膏等有机氮源。在初始糖含量为60%的情况下,该菌仍能较好的生长。该菌可耐受的初始氯化钠浓度约为12%。该菌对酒精较敏感,当酒精浓度高于8%时,细胞生长停滞。该菌生长的最适pH和温度分别为6.0和30oC。季也蒙毕赤酵母SC1103经驯化、诱导及固定化后,其催化活性以及底物耐受水平均显著增加。当HMF浓度为200-300 mM时,以固定化细胞为催化剂,反应7-24 h后BHMF产率为82-85%,选择性为99%。在放大合成中,7 h内体系中积累了高达181 mM的BHMF,其时空收率约为3.3 g·L-1·h-1;经简单的有机溶剂萃取,产物回收率达92%,纯度约为90%。此外,固定化细胞表现出较好的操作稳定性,重复使用4次后细胞存活率仍为70%。以水稻秸秆水解液替代葡萄糖作为辅底物,BHMF产率为88%,选择性约为89%。将该体系应用于糠醇的合成中,以葡萄糖为辅底物时糠醇产率显著高于以甘油和甲酸钠为辅底物的产率。在糠醇的放大合成中,当糠醛浓度为200 mM时,在7 h内积累了大约157 mM的糠醇,糠醇产率为79%。经有机溶剂萃取后,产物回收率为90%,纯度约为88%。采用底物分批流加方式,反应11 h后糠醇浓度为178 mM。本研究不仅初步阐明了固定化细胞催化HMF及糠醛选择性还原反应的特性及规律,丰富了生物催化生物基平台化合物高值化转化的理论基础,而且还将为大规模合成BHMF及糠醇提供技术支持。
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