登革热（dengue fever, DF）是由登革病毒 (dengue virus, DENV) 感染引起的一类急性传染病， 有时会发展为可致命的重症登革热（登革出血热）。登革热病毒属于黄病毒科黄病毒属，分为4个血清型（DENV1、DENV2、DENV3 和DENV4）。主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊叮咬传播。一直是热带和亚热带国家和地区的重要公共卫生问题。　　由于缺乏有效的疫苗和治疗药物，加上蚊虫孳生及抗药性问题日益凸显，迫切需要寻找一种新的策略来防控蚊媒病毒在自然界的传播。蚊作为病毒的自然宿主和传播媒介，其体内拥有一套完善的免疫系统来限制病毒的感染，从而避免病毒对蚊正常生理功能的破坏，但具体机制尚不清楚。因此，阐明蚊的抗病毒免疫机制，不仅将加深我们对昆虫免疫系统的认知，而且为阻断病毒在蚊体内的传播提供潜在的干预靶点，从而为蚊媒传染病的防控奠定理论基础。　　登革病毒感染宿主细胞后，宿主细胞通过自身的免疫系统来建立一套自我防护措施。因此，从宿主本身入手探索宿主先天性免疫对抗病毒感染以及研究病毒与宿主互作机制具有重要的意义。目前，在果蝇和埃及伊蚊中研究的天然免疫抗病毒通路主要有:JAK-STAT途径，Toll途径，IMD途径，RNAi途径。JAK-STAT途径在埃及伊蚊抗DENV免疫中发挥重要作用，并发现了两种参与抑制DENV感染的因子 DVRF1和DVRF2。另外，激活埃及伊蚊体内的Toll途径和IMD途径可抑制DENV在其中肠和唾液腺中的增殖。当登革病毒基因组dsRNA转染埃及伊蚊细胞或胚胎，能够抑制病毒复制，而且在细胞内能检测到与登革病毒mRNA结合的siRNA。沉默埃及伊蚊RNAi关键基因Dicer2后，蚊体内DENV基因组的复制水平和病毒的滴度均提高了4-10倍。　　此外，细胞外调节蛋白激酶（ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路家族中的一个重要信号通路。ERK通路在DNA病毒和RNA病毒感染致病以及宿主防御过程中具有重要作用。研究表明ERK通路在果蝇中肠发挥抗多种果蝇病毒的作用，机制尚不清楚。ERK通路是否在蚊对抗病毒感染时发挥作用，未有报道。　　目的:　　登革病毒感染白纹伊蚊C6/36细胞后，细胞天然免疫信号通路的分析；研究白纹伊蚊MAPK-ERK通路抗登革病毒功能与机制；揭示2017年登革病毒杭州流行株感染白纹伊蚊细胞激活其MAPK-ERK通路。　　方法:　　1.感染登革病毒NGC株的白纹伊蚊细胞转录组测序分析　　登革病毒NGC株感染单层白纹伊蚊C6/36细胞，72 h后做间接免疫荧光实验，确认病毒感染。同时收集细胞制备样品，提取细胞总RNA，交给杭州联川公司进行转录组测序。对差异表达基因进行筛选，GO分析以及KEGG分析。随后，对登革病毒不同时间段（ 0 h, 24 h, 48 h, 72 h ）感染的C6/36细胞进行RT-qPCR，检测MAPK-ERK通路的主要基因Ras, Raf以及下游转录因子LZ的mRNA水平。　　2.白纹伊蚊细胞和幼虫的MAPK-ERK通路激活与抑制　　登革病毒感染C6/36细胞，分别0 h, 2 h, 6 h, 12 h收细胞样品制备蛋白， Western Blot检测ERK的磷酸化水平和总ERK的水平，以β-Actin为内参。重组人胰岛素（Insulin）20μg/mL作用于C6/36细胞，分别15 min, 30 min, 1 h, 6 h收样制备蛋白，Western Blot检测ERK的磷酸化水平和总ERK的水平。ERK通路特异性抑制剂U0126 10μM处理C6/36细胞30 min后收样制备蛋白，Western Blot检测ERK的磷酸化水平和总ERK的水平。重组人胰岛素500μg和U0126 500μM分别以及共同作用于白纹伊蚊幼虫，加药6 h后制备各组幼虫的蛋白， Western Blot检测ERK的磷酸化水平和总ERK的水平。　　3.MAPK-ERK通路抗登革病毒的功能与机制　　重组人胰岛素（Insulin）20μg/mL和ERK通路抑制剂U0126 10μM预处理白纹伊蚊C6/36细胞30 min后进行登革病毒感染实验。登革病毒吸附细胞两小时后吸去，加入含2%FBS的1640维持培养液。分别培养24 h和36 h后收集细胞，提细胞总RNA,以白纹伊蚊C6/36细胞RPS7基因为内参，RT-qPCR检测登革病毒NS1基因的复制水平，间接免疫荧光检测登革病毒E蛋白的表达水平。此外，先用U0126 10μM预处理C6/36细胞30 min后，再用重组人胰岛素（Insulin） 20μg/mL作用30 min，进行登革病毒感染实验，36 h后收集细胞，RT-qPCR检测登革病毒NS1的复制水平。　　利用RNAi基因沉默技术下调ERK通路关键基因Ras的表达，随后进行登革病毒感染实验，24 h后RT-qPCR检测登革病毒NS1的复制水平。　　重组人胰岛素（Insulin）20μg/mL和ERK通路抑制剂U0126 10μM处理C6/36细胞6 h后收集细胞，提总RNA, RT-qPCR检测ERK通路下游转录因子LZ的mRNA水平。利用LZ的siRNA干扰C6/36细胞的LZ后，进行登革病毒感染实验，24 h后收集细胞提取总RNA，RT-qPCR检测登革病毒NS1的复制水平。4. 2017年登革病毒杭州流行株的分离鉴定及其激活白纹伊蚊MAPK-ERK通路　　2017年杭州不同地区采集15例登革热病人血标本经离心取血清，过滤后进行感染白纹伊蚊C6/36细胞实验，分离得到病毒。提取细胞培养上清和血清中的病毒RNA,再逆转录反应形成cDNA。分别利用巢式PCR和多重PCR特异性引物鉴定出登革病毒的型别。鉴定出为Ⅱ型登革病毒后，利用5对特异性测序引物，进行Sanger测序，根据测序序列做进化树进行基因型分析。　　杭州株登革病毒感染C6/36细胞，分别0 h, 2 h, 6 h, 12 h收细胞样品制备蛋白，Western Blot检测ERK的磷酸化水平和总ERK的水平，以β-Actin为内参。　　结果:　　1.转录组测序结果显示MAPK通路中多数基因在登革病毒感染后显著上调。　　2.Ⅱ型登革病毒、重组人胰岛素（Insulin）分别作用白纹伊蚊C6/36细胞后，ERK的磷酸化水平显著增加，总ERK水平保持不变。而特异性抑制剂U0126单独或者与Insulin共同处理C6/36细胞后，ERK磷酸化水平显著降低，总ERK水平同样保持不变。另外，在白纹伊蚊幼虫实验中得到了相同的结果。　　3.Insulin预处理C6/36细胞组，登革病毒的复制水平显著降低。U0126预处理组，登革病毒的复制水平显著升高。Insulin与U0126共同处理组，登革病毒的复制水平依然显著上调，并且与U0126单独处理组比较无统计学意义。　　4.RNAi分别下调Ras和转录因子LZ后，登革病毒的复制水平显著升高。而且Insulin作用C6/36细胞后，LZ水平显著升高；U0126处理C6/36细胞后，LZ水平显著降低。　　5.2017年登革病毒杭州流行株PCR鉴定均为Ⅱ型登革病毒，Sanger测序结果分析基因型，其中有13例为全球型（ Cosmopolitan ） ， 2例为亚洲-美洲型（Asian/American）。登革病毒杭州株感染白纹伊蚊C6/36细胞后，ERK的磷酸化水平显著升高。　　结论:　　1.登革病毒感染白纹伊蚊细胞能够激活其MAPK-ERK通路。　　2.白纹伊蚊MAPK-ERK通路发挥抗登革病毒的功能，并且通过激活转录因子LZ来调控抗病毒基因表达，从而抑制病毒的复制。　　3.2017年登革病毒杭州流行株鉴定为Ⅱ型，包含两种基因型即全球型和亚洲/美洲型，并且同样能够激活白纹伊蚊MAPK-ERK天然免疫通路。