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目的:肾脏缺血再灌注损伤在临床上很常见。减轻和避免肾缺血再灌注损伤在临床上有重要意义。本实验通过以下三个方面来研究谷氨酰胺对大鼠肾脏缺血再灌注的保护作用。为临床上用药提供参考。1观察大鼠应用谷氨酰胺后体内血药浓度的变化以论证谷氨酰胺的最佳作用剂量和时间。2通过应用谷氨酰胺(Gln)后并设立对照组,利用病理切片和免疫组化的方法观察大鼠肾脏缺血再灌注损伤的变化和大鼠肾脏小管细胞凋亡的变化。观察谷氨酰胺是否减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤。3通过应用热休克蛋白阻滞剂栎黄皮桐(Quercetin)并设立对照组,探讨谷氨酰胺减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤与诱导大鼠肾脏热休克蛋白产生的关系。论证其对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用的机理。方法:1, 12只S-D大鼠,雌雄不限,随机分为2组,每组6只,分别给予不同剂量谷氨酰胺(0.75g/kg和0.375g/kg)运用液相法测量0,15,30,45,60,120分钟大鼠体内的血药浓度。2 , 48只S-D大鼠,雌雄不限,随机分为4组,每组12只,分别不同的方法进行干预:A组:谷氨酰胺(Gln)组。经尾静脉给与谷氨酰胺(Gln)0.75g/kg.B组:生理盐水对照组。给予生理盐水作为对照,剂量和推注速度不变。C组:栎黄皮桐(quercetin)组。提前六小时腹腔注射给予栎黄皮桐(quercetin)一种热休克蛋白阻滞剂,剂量400mg/kg。然后同A组方法给予谷氨酰胺。D组;栎黄皮桐对照溶剂组。提前六小时腹腔注射对照溶剂。然后同A组方法给予谷氨酰胺。A,B,C,D四组药物干预后1小时内建立大鼠肾脏缺血再灌注模型,分别于再灌注6小时,24小时处死动物,抽血离心生化分析血肌酐和尿素氮,并取双侧肾脏标本,HE染色光镜下观察肾脏损伤情况并计分统计肾小管损伤程度。免疫组化和Western-Blot观察热休克蛋白(HSP-70)的表达。Tunel法观察肾脏细胞凋亡并统计凋亡指数。结果:1、谷氨酰胺血药浓度变化本实验测谷氨酰胺的血药浓度变化:在应用0.75g/kg的谷氨酰胺给大鼠尾静脉注射后一小时内血药浓度为3-7mmol/l。一小时后血液中谷氨酰胺浓度下降于3mmol/l以下。而在应用0.375g/kg的谷氨酰胺给大鼠尾静脉注射时,血药浓度达不到3 mmol/l。由于文献报道谷氨酰胺诱导热休克蛋白的最大有效浓度为3-7 mmol/l。故本实验发现在大鼠静注0.75g/kg的谷氨酰胺后一小时之内的血药浓度为诱导热休克蛋白的最大有效浓度。2肾缺血再灌注后两时间点的肌酐,尿素氮变化:各组实验结果表明大鼠肾脏缺血再灌注24小时后肌酐和尿素氮显著高于缺血再灌注6小时后(P<0.05)。A,D两组运用了谷氨酰胺干预后,肌酐,尿素氮与B组相比明显下降(P<0.05)。而C组与其他三组相比肌酐,尿素氮明显增高(P<0.05)。3肾缺血再灌注后两时间点病理切片HE染色结果:镜下观察可见A,D两组损伤情况类似,主要表现为肾小管上皮细胞变扁平,刷状缘脱落,组织轻微充血,有少量细胞坏死和脱落。B组表现为肾上管上皮坏死,细胞脱落,蛋白管型形成。组织有比较严重的充血。C组表现较多的肾上管上皮坏死,细胞脱落,细胞管型形成。组织大面积充血。Paller氏计分结果表明:A,D两组与B组比较损伤明显减轻(P<0.01)。C组损伤重于B组(P<0.01)证明应用谷氨酰胺对肾脏缺血再灌注损伤有保护作用,在应用了热休克蛋白阻滞剂(Quercetin)后这种保护作用消失,同时可能由于阻滞了缺血再灌注损伤本身诱导热休克蛋白产生的作用。导致损伤进一步加重。A,D两组组内计分有统计学差异(6小时损伤重于24小时),而B,C组组内没有这种差异,表明B,C两组随着时间的延长损伤没有显著差别(P>0.05)。而A,D两组可能是由于谷氨酰胺诱导了大量热休克蛋白的产生而起到了修复损伤的作用。随着再灌注时间的延长,损伤渐渐减轻。(P<0.05)。4肾缺血再灌注后两时间点免疫组化热休克蛋白染色结果:镜下见A,D两组HSP-70呈强阳性,呈棕褐色,细颗粒状,弥漫分布于细胞浆。B组6小时组HSP-70呈弱阳性,呈淡黄色,细颗粒状,弥漫分布于细胞浆,24小时组HSP-70呈阳性,呈棕黄色,细颗粒状,弥漫分布于细胞浆,相对于A组表达弱,但相对于B组6小时表达明显。C组棕黄色染色区域很少,几乎没有表达。热休克蛋白染色镜下评分结果:统计结果表明A,D两组与B组比较热休克蛋白表达明显增强(P<0.01),而C组与B组相比热休克蛋白表达明显减弱(P<0.01)。A,C,D组组内比较没有统计学差异,证明热休克蛋白在6小时和24小时表达量没有时间上的差异。而B组24小时的热休克蛋白表达要高于6小时,证明正常大鼠肾脏缺血再灌注后热休克蛋白的表达似乎24小时要比6小时有所增强。5肾缺血再灌注后两个时间点Westen-blot检测结果:6小时A,D两组表达最强,B组表达弱于A,D组,强于C组。24小时A,D两组表达最强,B组弱于A,D组,强于C组。热休克蛋白表达两个时间点结果一致,和免疫组化结果也一致。由于不是同一时间下电泳,因此无法比较同一组的组内差异。6 Tunel法观察细胞凋亡结果:镜下观察所见:A,D两组见散在凋亡细胞。C组凋亡细胞数量多见。B组凋亡细胞可见。数量多于A,D组,少于C组。凋亡指数统计结果:A,D两组与B组相比凋亡指数明显降低,有统计学意义(P<0.01)。C组与B组相比凋亡指数明显升高,有统计学意义(P<0.01)。A,D两组相比没有差异(P>0.05)。A,B,C,D四组凋亡指数组内比较没有差异。(P>0.05)。这一结果说明谷氨酰胺诱导热休克蛋白可以减轻细胞凋亡。而应用Quercetin阻滞热休克蛋白产生后,这种抑制细胞凋亡的作用消失,而且由于抑制了细胞本身缺血再灌注后正常热休克蛋白的产生,导致抑制凋亡的作用进一步下降。细胞凋亡加重。结论:本实验研究得出相关结论如下:1,本实验测得的谷氨酰胺的血药浓度与文献研究结果是一致的,大鼠在应用0.75g/kg的谷氨酰胺尾静脉注射后一小时内血药浓度为3-7mmol/l。此为诱导大鼠器官热休克蛋白表达的最佳有效浓度。一小时后谷氨酰胺血药浓度下降,达不到诱导大鼠器官热休克蛋白表达的最佳有效浓度。同样应用0.375g/kg的谷氨酰胺静注后的血药浓度也达不到最佳有效浓度。2,在大鼠肾缺血再灌注前一个小时内应用谷氨酰胺证明对肾脏功能有保护作用。肌酐,尿素值测定,HE染色下观察和记分统计,Tunel法检测细胞凋亡等实验证据都支持应用谷氨酰胺后损伤减轻。3,经过免疫组化和Westen-blot的方法实验证据表明在谷氨酰胺组肾脏损伤减轻的同时肾脏大量表达热休克蛋白即Hsp-70。4,通过设立Quercetin组即C组为对照,表明谷氨酰胺的这种对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用主要是诱导了肾脏产生大量的热休克蛋白,即Hsp-70。这种保护作用是通过热休克蛋白来发挥作用。阻滞了热休克蛋白即Hsp-70的产生,这种保护作用消失。5,免疫组化染色镜下观察和计分统计结果都发现大鼠肾缺血再灌注后自身可以诱导热休克蛋白,在24小时热休克蛋白的表达要大于6小时,而应用谷氨酰胺后这种时间上的差异没有统计学意义。说明谷氨酰胺诱导热休克蛋白的表达6小时已经达到或接近最大量。6,HE染色镜下观察和计分统计,应用谷氨酰胺组的24小时的损伤情况要轻于6小时。而对照组则没有明显的损伤差异。由此推测谷氨酰胺诱导肾脏产生的大量热休克蛋白已经起到了修复损伤的作用。7. Tunel法检测细胞凋亡等实验结果表明:谷氨酰胺诱导热休克蛋白可以抑制细胞凋亡。阻滞了热休克蛋白,这种抑制作用消失。总之,本实验似乎支持谷氨酰胺可以减轻大鼠肾脏的缺血再灌注损伤,其机理可能与诱导大鼠肾脏表达热休克蛋白,即Hsp-70有关。