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副结核病(Paratuberculosis)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)引起的反刍动物慢性不可逆的消耗性疾病,以顽固性腹泻、渐进性消瘦和肠黏膜增厚形成皱襞为特征。该病在世界范围内广泛流行,给养牛业和乳品业造成了严重的经济损失。因此,迫切需要深入研究MAP的致病机制,从而为副结核病的疫苗研发及诊断治疗提供有力的科学支持。本研究通过生物信息学预测,MAP中存在一个可能具有编码丝氨酸蛋白酶基因—map3292c,通过PCR扩增、表达载体构建及原核表达纯化获得了MAP3292c蛋白,研究结果表明MAP3292c蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性,通过casein定量的方法,确定了MAP3292c蛋白的最佳作用温度及pH分别为41℃和9.0,证实钙离子能促进MAP3292c蛋白酶活性的发挥。定点突变试验结果表明63H、87D和238S氨基酸残基为MAP3292c的活性中心,特别是238S位点对MAP3292c蛋白酶的活性起着决定性的作用。并且MAP3292c还能通过降解LL-37而破坏其杀菌活性。将map3292c基因连接pMV261穿梭载体,电转入耻垢分枝杆菌后构建重组耻垢分枝杆菌MAP3292c/MS。为了确定MAP3292c蛋白的亚细胞定位,应用差速离心法分别分离MAP3292c/MS和MAP K10参考株的培养上清(CF)、全菌体蛋白(CL)、细胞壁(CW)、细胞浆(CF)和细胞膜(CM)成分,应用抗MAP3292c蛋白的多克隆抗体,以Western Blotting方法确定了MAP3292c蛋白主要定位于细胞壁,并可分泌到培养上清中,少量定位于细胞膜上。为了研究MAP3292c蛋白的致病作用,以重组质粒pMV261-MAP3292c为模板,构建丝氨酸蛋白酶突变体重组菌S238A/MS,将重组菌MAP3292c/MS和S238A/MS分别感染5周龄BALB/c小鼠,以pMV261/MS为对照。结果表明,MAP3292c蛋白酶能够促进耻垢分枝杆菌在小鼠中的定殖能力,并引起小鼠肝、脾和肺不同程度的病理损伤,促进小鼠炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的释放。本研究不仅丰富了MAP的致病机制,也为副结核病的治疗和药物研发奠定了基础。