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研究背景和目的 容积敏感性外向整流性(Volume-sensitive outwardly rectifying，VSOR)Cl~-通道广泛分布于各种动物细胞，包括哺乳动物的心肌细胞。该通道作为容积调节性阴离子外流的主要途径，在细胞的渗透性肿胀引起调节性容积减小(RVD)过程中起着非常重要的作用。除此之外，VSOR Cl~-通道还参与细胞增殖、细胞周期的建立、细胞凋亡等多种生理及病理生理过程。然而，关于该通道的分子属性至今仍不清楚。 ClC-3是多个VSOR Cl~-通道的候选基因中提出最晚且仍存在争议的一个基因，属于哺乳动物Cl~-通道基因家族(CLC)的一个成员。提出ClC-3假说的依据之一是把从豚鼠心脏克隆的ClC-3即豚鼠ClC-3(gpClC-3)转染到NIH／3T3细胞进行表达，再通过膜片钳技术记录到一个具有基础活性的Cl~-电流，该电流与豚鼠心肌细胞内生性VSOR Cl~-电流之间存在许多相似的电生理学特性；依据之二是ClC-3的位向性基因突变改变了该通道的外向整流性以及阴离子选择性；依据之三是几种不同的ClC-3抗体抑制心肌细胞、肺动脉平第四军医大学博士学位论文滑肌细胞、以及蟾蛛卵母细胞内生性VSORcl一电流;依据之四是HeLa细胞和蟾蛛卵母细胞内生性VSORCI一电流受到CIC一3反义寡核昔酸和反义eRNA的抑制。 然而，CIC一3作为VSORCI一通道候选基因的假说自提出之初就受到相悖理论的冲击，不支持该假说的资料显示:世界多个实验室不仅未能功能性表达gPCIC一3，而且也不能表达小鼠、大鼠、以及人类CIC一3(mele一3、rCle一3和hele一3);hele一3基因转染到哺乳动物细胞并不影响其VSORCI一通道的激活;另外，hCIC一3或:CIC一3的异源表达所激活的Cl一电流的电生理学特性也有别于VSORCI一电流。 特别是近年来的研究表明:①缺乏CIC一3分子表达的大鼠泪腺细胞仍然存在VSOR Cr通道的功能性表达;②小鼠肝细胞和胰腺腺泡细胞的CIC一3基因标靶性破坏并不能影响其VSORCI一通道的激活;③从CIC一3基因敲除型小鼠分离的腮腺腺泡细胞所记录的肿胀激活性Cl一电流的幅度及动力学均与野生型小鼠的VSORCI一电流相同。由此认为，大鼠泪腺细胞、小鼠肝细胞、胰腺腺泡细胞、以及腮腺腺泡细胞胞膜的VSORCI一通道分子属性并不是CIC一3。 然而，即便如此，因为不能排除细胞种属差异对CIC一3假说的影响，所以仍不能定论心肌细胞VSORCI一通道的分子属性是否为CIC一3。本研究旨在探讨CIC一3基因敲除能否影响小鼠心室肌细胞VSOR CI一通道的功能性表达及其电生理学特点:VSORCI一通道是否受蛋白激酶C(P KC)调节、调节机制如何。从而阐明CIC一3是否为心肌细胞VSORCI一通道的候选基因、以及PKC在VSORCI一通道激活过程中的作用。研究方法 实验采用三种类别小鼠，即野生型(Clcn3十/+)、杂交型(Clcn了十/--)和纯合子型(曰‘心共)。根据基因打靶技术使c57BL/6小鼠的Clc一3基因失活。首先构建CIC一3基因敲除载体，再选择129/Sv衍生的E14第四军医大学博士学位论文胚胎干细胞(ES)进行电穿孔基因转移，得到同源重组、阳性克隆DNA的ES细胞，将这种ES细胞植入C57BL/6小鼠胚胎的胚泡腔内，使其参与胚胎的发育，从而得到嵌合体小鼠。再将这种129/sv嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠进行交配，从而获得ClcnJ十/+、Clcn了+/-和Clcn了刁三种类型小鼠。 经主动脉逆行灌流胶元酶获得小鼠单个心室肌细胞:反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)被用于验证实验鼠心肌组织CIC一3 mRNA表达;传统全细胞记录模式的膜片钳技术用于研究VSORCI一通道的生物物理学及药理学特性、以及PKC在VSORCI一通道激活过程中的调节作用。研究结果1 .R卜PcR结果显示:Clcn3+/+和clcn3十/一两种小鼠心肌组织存在 CIC一3 mRNA，与阳性对照的野生型小鼠脑组织的CIC一3 mRNA 水平相当，PCR产物与预想长度符合;在Clcn了丫一小鼠心肌组织 中则未能检测到CIC一3 DNA产物。2.在Clcn了十/+小鼠心室肌细胞上记录到的全细胞电流表现如下特 点:细胞外低渗激活性;中度外向整流性;刺激电位多+40一+60 mV时所产生的外向性电流表现时间依赖性失活;被Cl一通道阻 断剂—DIDS和5硝基一2(3一苯丙胺卜苯甲酸(NPPB)明显抑制; 电流一电压(I一V)曲线上的反转电位是碑2-04士0.06 mV(n二16)， 接近于Cl一离子平衡电位一38 mV;反转电位随细胞外液中Cl一离 子浓度的降低向去极化电位方向偏移。3.clc心+/-和acn了子两种小鼠心室肌细胞上全细胞阴离子电导的 生物物理学和药理学特性与Clcn了+/+小鼠相同，符合典型的 VSORCI一电流;而且，三种小鼠心室肌细胞被+l 00 mV或一100 mV电压刺激所产生的峰电流密度值比较均无显著性差异。4.佛波酷(PMA)在低渗条件下明显放大。‘n3+/+和cIc心干小鼠 心室肌细胞VSORCI一电流，PMA刺激所产生的全细胞电流仍然第四军医大学博士学位论文 呈现外向整流性和时间一电压依赖性失活。Clcn3十/+和acn3不小 鼠心室肌细胞被PMA刺激所增长的电流幅度在+l 00 mV时分别 为5 .21士0.61 pA/pF(n=7)和4.15士0.66 pA/pF(n=5)，在一100 mV 时分别为