神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）对神经元生长、分化和再生具有重要的作用。目前,提取自小鼠颌下腺的鼠神经生长因子（mouse NGF,m NGF）已成为治疗人类神经疾病的一种重要药物。虽然m NGF与人NGF（human NGF,hNGF）的同源性很高,但m NGF的生物学活性比hNGF低,且存在临床上的致敏性问题。因此,有必要开发hNGF药物以代替m NGF药物。转基因动物生物反应器是目前比较高效的用于生产药物蛋白的方法。猪唾液腺具备表达高活性的NGF蛋白的条件,且分泌量大,是作为转基因生物反应器生产hNGF的一个比较理想的动物器官组织。本课题组前人已通过随机整合的方式成功制备出能高效表达高活性hNGF的原代转hNGF基因猪。但还有一些问题需要深入研究,包括:原代转hNGF基因猪是否能正常繁殖并把高效分泌高活性hNGF的性状稳定遗传后代;如何分离纯化转hNGF基因猪唾液中的hNGF;如何解决猪内源NGF（pig NGF,p NGF）对纯化hNGF的干扰等。本研究以原代转基因猪为父本,生产出F1代转基因猪,通过Southern Blot证明了hNGF基因可从原代转基因猪稳定遗传至F1代转基因猪,并且通过酶联免疫吸附测定（enzyme linked immune sorbent assay,ELISA）检测到F1代转基因猪唾液中的hNGF蛋白浓度平均为10μg/ml左右;收集F1代转基因猪的唾液,通过层析法纯化提取其中的hNGF蛋白;用细胞培养法鉴定纯化提取到的hNGF蛋白的活性,发现其能有效促使大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC-12细胞）分化为类神经细胞,促进人红系白血病细胞（TF-1）增殖。为去除p NGF的干扰和污染,本研究还运用同源重组和CRISPR/Cas9定点打靶技术,以原代转基因猪成纤维细胞为基础,将其基因组中的p NGF基因替换成hNGF基因,经荧光判断、PCR和测序验证,筛选出3个符合预期的单克隆细胞团,并以其作为体细胞核移植的供体构建克隆胚胎,共往7头代孕母猪体内移植了1486个胚胎,用于制备p NGF基因敲除的转hNGF基因猪,预产期为5月上中旬。综上,本研究以课题组前人制备的原代转hNGF基因猪为父本生产出F1代转基因猪,从F1代转基因猪的唾液中纯化提取出了hNGF蛋白并进行活性检测;以原代转hNGF基因猪成纤维细胞为基础,筛选出了将p NGF基因替换为hNGF基因的单克隆细胞团并制备克隆猪。