大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin, LT）是一种能导致人畜腹泻的毒性因子，为产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia, ETEC）产生的六聚体蛋白。除了很强的毒性以外，LT 具有很强的免疫原性并且能够辅佐其他抗原通过粘膜免疫途径使机体产生特异抗体，因而 LT，尤其是其无毒或低毒突变体，还是良好的粘膜免疫佐剂，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗开发中具有重要医学价值和经济价值。另外，由于 LT 是由一个具有毒性的 A 亚单位（LTA）和形成环状的五个能够与神经节苷脂 GM1 结合而粘附于真核细胞膜上的 B 亚单位（LTB）组成，结构与功能都很复杂，不同位点的氨基酸突变会对其高级结构和功能产生各不相同的影响，因而研究 LT 的突变体，不但可以筛选出可以应用于临床的侯选粘膜免疫佐剂，而且还可拓宽我们对蛋白质结构与功能的认识。 研究目的：获得适应中试规模生产、具较高表达效率的 LT 及 LT 的 B 亚单位（LTB）表达系统。通过对 LT 的表达、纯化及保存的方法进行探索，寻找到 LT优化的表达、纯化及保存方案。初步筛选出毒性较小、粘膜免疫佐剂活性较高的LT 突变体，同时就氨基酸突变对 LT 结构与功能的影响作一些理论探讨。 研究方法：通过用改良的基因组提取方法从野生型产毒性大肠杆菌中提取到lt 基因。利用基因工程技术将其重组于表达载体中并转化宿主菌，在摇瓶中筛选优化的表达系统。改变 Immobilized D(+)-galactose 亲和柱平衡缓冲液及目的蛋白洗脱液的成分及 pH 值，优化纯化方案。通过对不同保存条件下的 LT 用 HPLC 作分子筛层析判断 LT 结构稳定性筛选出最佳保存方案。利用基因工程的定点突变技术，构建 LT 突变体。用在分子筛层析洗脱液中加入 1%SDS，观察在洗脱过程中 A280nm的区别判断 LT 与突变体之间结构稳定性的差异、从胰酶消化后 LTA 裂解出 LTA1的多少判断 LT 及突变体对胰酶的敏感性、用在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞毒性检测中导致 CHO 细胞变形的剂量和程度及在 Patent-mouse 活体毒性检测中导致肠内液体的多寡判断 LT 及突变体的毒性。LT 突变体的粘膜免疫佐剂效应由下述方法进行评价：将 LT 突变体作为幽门螺杆菌（Hp）尿素酶 B 亚单位（UreB）的佐剂，口服免疫 BALB/c 小鼠，用 ELISA 法检测血清及粘膜部位抗原特异的抗体水平、用 ELISPOT 法观察肠派伊尔结（PP 结）抗体分泌细胞、用 RT－PCR 法检测细胞因子的差别表达并与其他佐剂及疫苗进行比较。 研究结果： 1、用改良基因组提取法从野生型产毒大肠杆菌中提取到含 lt 基因的质粒。 2、 在生长于改良 M9－CAA 培养基的含 pET11c-LT 重组质粒的 E.coli I<WP=6>重庆大学博士学位论文BL21(DE3)中以约 46mg/L 培养基的较高效率分泌表达出重组 LT。 3、 LT 在纯化后马上冻干并保存于 4℃可以长久保持其完整的六聚体结构。该法可避免 LT 以液态形式在缓冲液中 4℃或－70℃保存一定时间后发生解聚现象。 4、 构建了 LTK63（第 63 位氨基酸由 S K），LTR72（第 72 位氨基酸由 A R）和 LTKR（第 63、72 位氨基酸分别由 S、A 突变为 K、R）。 5、LTA2 结构域内的第 229、230、232、233 位的 4 个氨基酸由 E、V、I、Y分别突变为与霍乱毒素该 4 个氨基酸相同的 D、I、T、H，命名为 LTDITH，同时构建了 LTK63，LTR72 和 LTKR 的相应的 LTA2 结构域突变体 LTKDITH、LTRDITH和 LTKRDITH。另外还将 LTDITH 的第 232 位氨基酸突变为 Lys，命名为 LTDIKH。 6、 对重组 LT 及其突变体进行了中试规模发酵并纯化后统计发现 A2 结构域特定突变后的 LT，其表达效率大大提高，可达 160mg/L 培养基。 7、 用 HPLC 对野生 LT 及各种突变体进行结构稳定性检测后， A2 结构域特定突变后的 LT 其稳定性大大增加。相对于 LT，LTK63 结构稳定性增加；LTR72结构稳定性降低；LTKR 结构稳定性增加。 8、 LTA2 结构域特定突变后的 LT 的胰酶敏感性降低。LTK63、LTKR 比 rLT及 LTR72 的胰酶敏感性降低。 9、 用 CHO 细胞毒性检测实验和 Patent-mouse 毒性检测实验表明，LTDITH的毒性显著低于 rLT。 10、 pET22b(+)-LTB/E.coli BL21(DE3)表达系统使 LTB 在 pelB 信号肽的引导下既可分泌表达至胞周质，也可使 LTB 以包含体形式存在。分泌表达的 LTB 能用半乳糖亲和柱一步纯化出来，包含体形式存在的 LTB 能通过溶解、缓冲液置换后，再用半乳糖亲和柱纯化，两种方法纯化的 LTB 具有相同的氨基酸组成并且具有正常的免疫原性和 GM1 结合活性。 11、 LT 突变体及 LTB 在与 Hp 尿素酶 B 亚单位（UreB）通过口服途径免疫小鼠后具有明显的佐剂效应，血清 IgG、粘膜部位的 sIgA、PP 结抗体分泌细胞及细胞因子如 IL-4、IFN-γ 的表达都明显增加。 结论：改良的基因组提取方法是提取大质粒的简便方法。用 HPLC 结合分子筛层析可以判断 LT 的结构稳定性。LTK63 对 LT 六聚体的结构还有明显的影响。LTDITH 及基于 LTDITH 的突变体能显著改变 LT 的结构与功能，即增加