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背景和目的:精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)具有自我更新的能力,是雄性动物体内唯一能将遗传信息传递给后代的干细胞。因此,SSCs将会为干细胞生物学、雄性不育治疗、濒危动物保护、转基因动物生产、高产优质家畜培育等研究提供一种新的强有力工具。自1994年Brinster首次建立SSCs移植技术以来,运用这一技术,亦有转基因动物的问世。SSCs移植技术在羊、牛、猪、鸡等动物上取得了较大的进展。然而,由于犬生殖生理及雌性配子结构的特殊性,以传统的原核显微注射法,人类至今未能获得转基因犬;同时,也未见有通过SSCs分离、体外基因转染及移植的方法来制备转基因犬的相关报道。本研究以小鼠为模型,开展SSCs分离、培养、转染及移植的研究,在此基础上,对犬SSCs的分离、培养、转染、移植及无精子症犬模型构建做了探索性的研究,为利用转基因SSCs移植法制备转基因犬奠定了理论和技术基础。
研究内容与方法:①实验动物:用作SSCs分离的动物,分别选择7-8日龄的ICR公鼠,4-4.5月龄的公犬。②SSCs的分离:采用0.2g/L胶原酶-0.25%胰蛋白酶的复合酶消化法制备单细胞悬液。③SSCs的纯化和培养:以差速贴壁法纯化SSCs,将纯化后的SSCs接种培养子支持细胞饲养层上,并DMEM+10%胎牛血清+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1%双抗+1%丙酮酸钠为基础培养液培养。④SSCs的体外基因转染:以绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为外源基因,采用阳离子聚合物法(含血清体系和无血清体系)和磷酸钙法转染SSCs,比较转染后EGFP的表达情况。⑤无精子症动物模型的构建:小鼠采用腹腔注射不同浓度白消安(20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg)的方法筛选消除内源性SSCs的合适浓度;犬采用肌肉注射不同浓度白消安(8mg/kg、12mg/kg、15mg/kg)的方法筛选消除内源性SSCs的合适浓度。⑥转EGFP基因SSCs的移植:将转染EGFP基因的SSCs移植到白消安消除其内源性生精上皮的受体小鼠/犬睾丸内,并于移植后不同时间段分别切取受体鼠和犬的睾丸,制作冰冻切片,在荧光显微镜下观察表达情况。并对受体睾丸基因组DNA进行PCR扩增检测。
结果:①SSCs的分离、纯化和培养:7-8日龄是用于小鼠SSCs分离的最佳年龄段,4-4.5月龄是用于犬SSCs分离研究的最佳年龄段;采用0.2g/L胶原酶-0.25%胰蛋白酶复合酶消化法消化生精上皮,小鼠和犬SSCs活率分别达到97.73%和95.81%;所获得的SSCs经差速贴壁法纯化后纯化率为60.78%(小鼠)和50.86%(犬);将纯化后的SSCs培养于支持细胞饲养层上,SSCs贴壁时间为培养8h-12h,SSCs呈扁平圆形或卵圆形,大小均一,单个散在或多个成团、链状存在。②SSCs的体外基因转染:磷酸钙法、阳离子聚合物法(含血清体系)和阳离子聚合物法(无血清体系)均可将外源EGFP基因导入SSCs中,并能表达绿色荧光蛋白。磷酸钙法对小鼠和犬SSCs的转染率分别为8.12%和7.96%;阳离子聚合物法(含血清体系)对小鼠和犬SSCs的转染率分别为22.14%和23.69%;阳离子聚合物法(无血清体系)对小鼠和犬SSCs的转染率分别为21.58%和24.01%。③白消安对内源性SSCs的消除:根据动物的健康存活状态及睾丸组织学结构变化等,确定40mg/kg的注射剂量是消除小鼠内源性SSCs的有效剂量;12mg/kg的注射剂量是消除犬内源性生精细胞的有效剂量:④转EGFP基因SSCs的移植结果:小鼠于移植后1w、2w和3w的睾丸冰冻切片上观察到荧光,受体睾丸基因组DNA经PCR扩增后,扩增出了620bp的特异性条带;犬于移植后在冰冻切片上未见荧光,受体睾丸基因组DNA经PCR扩增后,未观察到特异性条带。
结论:本实验成功有效地分离培养了小鼠和犬的精原干细胞,在体外成功地将外源EGFP基因转染到小鼠和犬的SSCs内,并将转基因SSCs移植到无精子症动物模型的睾丸内,在移植后1w、2w和3w的小鼠睾丸冰冻切片上可见荧光,提示有EGFP基因的表达。上述实验为利用转基因SSCs移植法制备转基因犬奠定了理论和技术基础。