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苜蓿是世界上最重要的豆科牧草之一,广泛分布于全世界,对牛、羊等牲畜的生长具有重要的作用,被誉为“牧草之王”。在苜蓿品质指标中,含硫氨基酸和木质素的含量是两个重要的指标。本文通过转基因方法对紫花苜蓿的含硫氨基酸和木质素含量进行分子水平的改良,创制出高含硫氨基酸和纤维素含量的苜蓿新材料。含硫氨基酸可以明显提高牛奶和羊毛的质量和产量。AK和APR分别是含硫氨基酸代谢中天冬氨酸合成通路以及硫同化通路中的关键酶。前人研究中过表达单个基因均有提高含硫氨基酸含量的作用,同时从碳源和硫源两条代谢通路上增加含硫氨基酸底物是否能更有效地增加产物含量是本研究的课题。通过本实验室的多基因转化平台,将来自细菌的A/K和APR构建到同一个转化载体中,通过农杆菌遗传转化紫花苜蓿,运用PCR、Southern Blot、半定量RT-PCR、荧光定量PCR和Western Blot等分子检测方法,证明了这两个基因已整合到苜蓿基因组中,可以正常的转录和翻译并稳定遗传至Ti代,转基因苜蓿的生长表型及农艺性状没有发生显著变化。含硫氨基酸合成中的关键酶基因CGS、SAT MS的表达量均有不同程度的升高。氨基酸含量检测结果表明,T0代转基因植株中,半胱氨酸最高增加28.6%,甲硫氨酸最高增加58.8%,天冬氨酸增加30.7%>40.4%,赖氨酸增加38.7%-051.6%,而脯氨酸下降35.6%-40.0%,丝氨酸下降了 10%,O-酰基丝氨酸提高了 21.0%-47.5%。T1代转基因植株也得到相似的结果。氨基酸含量的变化通过草酰乙酸和α-酮戊二酸与TCA循环相联系,天冬氨酸家族氨基酸含量的增加伴随着谷氨酸家族氨基酸含量的降低,而半胱氨酸的增加伴随着它的碳源丝氨酸的降低。木质素含量过多会影响牧草的消化性和适口性。近年来,苜蓿由于其丰富的木质纤维素资源被认为是一种重要的下一代生物能源,但是木质素是纤维素转化成酒精的一大障碍。为了降低苜蓿中的木质素含量,本文利用多基因转化平台,通过RNAi方法和反义DNA方法,将合成木质素代谢同一通路中的关键酶基因HCT和C3H的干扰表达盒构建到同一转化载体中,通过农杆菌遗传转化紫花苜蓿。经过PCR筛选获得了转基因阳性植株,RT-qPCR结果表明HCT和C3H在转基因植株中表达明显下调。通过石蜡切片观察和木质素含量检测,发现与野生型相比,转基因苜蓿Line11的木质素含量最大下降380%,纤维素含量最大提高了 86.10%,并且转基因植株Line8的糖化效率显著提高了 20.9%,Line11细胞壁的降解率也显著提高了 13.0%。本文通过多基因转化技术调节苜蓿含硫氨基酸和木质素的代谢路径,获得了具有高含硫氨基酸和高纤维素的转基因株系,创制出优质苜蓿新材料,为植物分子育种提供了新思路和新方法,对草业和畜牧业的发展具有重要意义。