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目的本实验通过不同剂量的TRAIL单独或与顺铂联合作用于人胰腺癌细胞株PANC-1、PACA-2后细胞对药物的敏感性,探讨胰腺癌细胞发生TRAIL耐药的机制。方法本实验以人胰腺癌细胞株PANC-1、PACA-2为研究对象,将TRAIL分为不同浓度组(0.1 ng/ml、0.3ng/ml、1ng/ml、3 ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100 ng/ml、300 ng/ml、1000 ng/ml),将不同浓度TRAIL和/或顺铂联合作用于细胞,利用酸性磷酸酶法进行检测细胞的死亡率；通过Western blot检测细胞表达DR5、FADD. caspase-8、RIP、TRAF2、A20蛋白情况,以及caspase-8发生二聚化及裂解产物表达情况；通过siRNA技术获得PANC-1 A20-/-细胞株,检测其对不同浓度TRAIL的敏感性。结果①人胰腺癌细胞株PACA-2对TRAIL单独作用就很敏感,TRAIL分为0.1 ng/ml、0.3 ng/ml、1ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml、30ng/ml、100 ng/ml、300 ng/ml、1000 ng/ml浓度组给药,检测PACA-2细胞的死亡率,结果分别为5.90%、17.39%、26.76%、48.97%、68.00%、70.06%、72.81%、71.85%、71.71%。可见PACA-2对TRAIL诱导凋亡非常敏感。通过t检验分析,除0.1 ng/ml组外,其它各组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。②我们又将不同浓度的TRAIL作用于PANC-1, PANC-1细胞的死亡率分别是2.36%、4.15%、2.27%、5.10%、11.44%、21.26%、25.47%、26.08%、26.56%,当TRAIL浓度为10 ng/ml,与对照组相比,二者有显著性差异(P<0.05),比较结果,我们看出PACA-2对TRAIL诱导的凋亡作用敏感,而PANC-1对TRAIL诱导凋亡产生耐药。而后我们选择顺铂与不同浓度TRAIL联合作用于PANC-1细胞,细胞死亡率分别为4.78%、7.51%、7.39%、8.79%、22.47%、27.22%、30.65%、47.65%。可见联合作用组中,小剂量顺铂联合TRAIL作用于胰腺癌细胞PANC-1的协同效应,与单独TRAIL组相比具有明显的差异(P<0.05)。由此可见,单独应用TRAIL可以引起PACA-2细胞发生明显凋亡,而PANC-1不发生明显的凋亡,而联合应用组中,用顺铂处理细胞后可以改变其对TRAIL的敏感性,并可以明显增加TRAIL对肿瘤细胞的杀伤力。③Western blot结果发现：两株细胞只有A20蛋白表达不同,在PACA-2细胞中,A20表达明显降低,而在PANC-1细胞中,A20表达明显升高；其它蛋白表达均相近。通过TRAIL单独或与顺铂联合作用于细胞后,发现在PACA-2细胞中单独应用TRAIL就会出现caspase-8二聚化及裂解产物,而PANC-1需要TRAIL与顺铂联合作用才会出现caspase-8二聚化及裂解产物,说明PACA-2单独应用TRAIL组,PANC-1经TRAIL联合应用顺铂后,都会通过caspase-8活化,触发凋亡反应,使细胞发生凋亡。④我们通过siRNA技术获得了PANC-1 A20-/-细胞株,检测其对不同浓度TRAIL的敏感性,死亡率分别是8.53%、13.67%、19.16%、24.33%、25.24%、31.51%、38.26%、42.52%、50.07%。结果显示PANC-1细胞株在A20基因沉默后,经TRAIL诱导凋亡率明显升高,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。因此说明,A20高表达在PANC-1细胞耐药中起到了一定的作用,消除A20作用后,可以明显增加耐药细胞对TRAIL的敏感性。结论根据以上结果我们得出以下结论：(1)胰腺癌细胞株PACA-2、PANC-1经TRAIL作用后诱导凋亡敏感性不同, PACA-2为TRAIL敏感细胞株, PANC-1为TRAIL耐药细胞株。(2) TRAIL与顺铂对胰腺癌细胞PANC-1的协同杀伤作用是通过激活TRAIL凋亡传导途径实现的。(3)A20蛋白高表达是引起胰腺癌细胞PANC-1对TRAIL诱导凋亡耐药的机制之一,与DR5、FADD、TRAF2、caspase-8无关。