研究背景及意义原发性肺癌作为全球发病及死亡率最高的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率仍在逐年增高。据统计,2012年全球新发癌症病例约1410万,其中新发肺癌数180万(约13%),占第一位；死亡率亦是癌症之首。吸烟是其最严重的诱因,即使是非吸烟者,暴露于二手烟下也是重要的危险因素。特别是在相对落后的中国,工业发展所导致的严重环境污染和不断恶化的雾霾天气和肺癌发生、进展之间的正相关性,已经被国内外诸多权威组织及专家所证实。近些年来,肺癌的城市发病率已经高于农村发病率,并且出现了明显的年轻化趋势；男性的肺癌死亡率在全国位于第二位,女性的肺癌死亡率更是超过传统高发癌症诸如乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等,位居全国第一位。随着医学科学技术的发展进步,人们对于肺癌预防意识的逐渐提高,肺癌的早期诊断率也在不断地提高。在治疗手段的发展上,原发性肺癌的治疗目前已经由传统单独手术治疗转变为以手术根治性切除为主,放、化疗为辅的全方位综合性治疗。而靶向类药物的应用,也为肺癌的治疗开辟了一条新的道路,特别是对于已经失去了根治性手术切除机会的晚期肺癌患者。但是肺癌的长期生存率依然不能令人满意,仍有相当一部分的病人在被明确诊断时已处于中晚期,即使能够行根治性切除以及系统的淋巴结清扫,其术后的生存质量及满意度得不到明显提升。就总体来说,虽然在原发性肺癌的预防、诊断、治疗等各个方面都有了一定程度的提高,全世界肺癌患者术后5年总体生存率仍然维持在30%-40%,较之前未见明显改善。局部侵袭及远处器官的转移是在肺癌临床治疗当中面临的最大的难题,是导致肺癌患者死亡的主要原因。随着对恶性肿瘤侵袭、转移过程的不断深入研究,虽然确切的机制仍没有被阐明,但人们发现其是一个复杂的、连续的并且内在相互联系的多阶段生物病理学过程。包括恶性肿瘤细胞之间粘附能力的下降、肿瘤细胞脱离基底膜、细胞外基质的异常降解、肿瘤细胞侵入周围微小淋巴管或血管并随循环定位于远处器官、附着于血管或淋巴内皮细胞、穿透管腔、诱导病理性微血管的生成,微小转移病灶的形成以及肿瘤转移灶周围微环境的形成和肿瘤细胞逃避宿主抗肿瘤免疫反应等一系列步骤。类似一个闭合的串联回路,从理论上来说,在以上所述多环节连续过程中的任何一个节点将其切断,就能够有效的阻止癌细胞的侵袭与转移。而大量分子生物学研究已经证实,许多分子、基因的特异性改变在上述进展的任意一个环节中均发挥了至关重要的作用。研究肺癌细胞在侵袭、转移中所蕴含的分子机制、选择行之有效的治疗方案,是当今肺癌研究的热门课题。因此,寻找能够影响肺癌进展并指示患者预后的分子标记物也是目前迫切需要解决的问题。除此之外,对于临床医生为肺癌术后患者选择针对性的辅助治疗也具有十分重要的指导性意义。热休克反应(Heat Shock Response, HSR)是一种能够保护细胞或器官在缺氧、缺血、过热、炎症以及其它有害应激源存在时免于损伤的保护性应激反应。热休克因子(Heat Shock Factor, HSF)作为参与HSR的转录调节因子,包括HSF1, HSF2, HSF3, HSF4这4种亚型,其中HSF1为最主要的应激调节因子。HSF1其在结构和功能上具有高度的保守性及广泛的同源性,在真核生物中普遍存在。主要由靠近氨基末端的DNA结合域、中间的三聚化结构域和羧基端的转录激活域组成。应激状态下,细胞质中的无活性HSF1通过三聚化后转入细胞核内成为转录激活子,并通过DNA结合域与基因中热休克转录原件位点上的5’-nGAAn-3’反向重复序列相结合,诱导热休克蛋白的生成并进一步行使其分子伴侣的功能。长久以来的研究表明,许多肿瘤细胞中都含有异常增高水平的热休克蛋白,是肿瘤细胞发生、生存、进展的重要因素,对于HSF1在恶性肿瘤中所发挥的作用却少有研究。然而现在,科学家发现HSF1不但增加肿瘤中热休克蛋白的表达,而且对肿瘤细胞的恶性行为也有更加直接、广泛的调控作用。多种肿瘤相关基因中都含有热休克转录原件,HSF1在人类乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等中都存在异常的表达,在肿瘤细胞转化、肿瘤生成、进展以及耐药性等方面都扮演了重要的角色。有研究表明HSF1在原发性肝癌中促进了肝癌细胞的侵袭和转移能力。另外,最近的研究显示,在乳腺癌中HSF1的异常升高通过抑制低氧诱导因子la (Hypoxia Ischemia Factor-la, HIF-1α)的降解促进了肿瘤血管生成。因此,HSF1蛋白可能在肿瘤发展中的血管生成这一至关重要的环节中具有潜在的调节控制作用。然而在非小细胞肺癌中,HSF1是否能够影响肿瘤血管的生成以及其中可能的机制尚不明确。趋化因子受体(Chemokine Receptor, CXCR)作为一种能够介导趋化因子信号并行使功能、七次跨膜的G蛋白偶联受体,由位于胞外的N端、胞外环、跨膜α螺旋、胞内环、C端等组成。通常在淋巴细胞、造血干细胞、内皮细胞等的细胞膜上有大量的表达。当趋化因子与相应受体的细胞外环相结合,使受体激活,进一步活化位于胞内的G蛋白,将信号传导入胞内,并继续激活下游的信号分子,使细胞从趋化因子低浓度区域向高浓度区域定向移动,在免疫应答、应激、干细胞迁移以及淋巴细胞归巢等许多的病理、生理过程中都起到关键的作用。除此之外,现在的研究发现,趋化因子-趋化因子受体信号轴在肿瘤细胞发生、发展中都起到了关键性的作用。CXCR4在肺癌、乳腺癌、结直肠癌中均被发现有过表达,其唯一配体基质衍生因子1 (Stromal-derived factor 1, SDF-1)与之结合后,能够诱使肿瘤细胞以类似炎症细胞趋化过程的形式向特定的远处器官、组织转移。而淋巴结、脑、骨髓、肝脏等肺癌的转移高发器官和组织也正是趋化因子SDF-1高表达的位置。然而目前的研究主要集中在SDF-1/CXCR4信号轴本身及其下游信号通路的传导上,对肿瘤细胞内CXCR4异常高表达的原因所进行的研究则不多。本实验通过免疫组织化学染色、Western blot和PCR等方法来检测HSF1蛋白在非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)中的表达,分析研究二者之间存在的生物学行为及术后生存率；另外,研究CXCR4在NSCLC中的表达以及HSF1与CXCR4之间的统计学意义；细胞实验研究HSF1对NSCLC细胞增殖、侵袭、转移等能力的影响；进一步探讨SDF-1/CXCR4信号轴在HSF1蛋白促进NSCLC进展中的作用以及相关的下游分子机制。第一部分：HSF1蛋白表达与非小细胞肺癌血管生成及预后的相关性研究目的检测NSCLC组织中HSF1蛋白的表达水平及微血管密度(Microvessel Density, MVD),进一步探讨和评估HSF1蛋白与患者各项临床病理指标、肿瘤血管生成以及术后长期生存率之间的关系。方法收集从2003年1月到2007年8月就诊于山东大学齐鲁医院胸外科共105位确诊为NSCLC的患者的相关临床资料。免疫组织化学染色法被用来检测非小细胞肺癌病理组织切片中HSF1蛋白及CD34的表达水平；通过计数CD34阳性染色的血管内皮细胞数来计算肿瘤组织中MVD。应用SPSS19.0统计学软件建立数据库并进行分析。χ2检验被用来统计分析HSF1蛋白、MVD分别与各个临床分类指标之间的关系；生存曲线通过Kaplan-Meier方法来绘制；通过Log-rank检验方法统计不同分组患者之间的生存差异；Cox多因素回归分析法验证患者的独立预后因素。P<0.05被视为有统计学差异性。结果HSF1蛋白过表达在NSCLC肿瘤组织中普遍存在。在本次试验的105例NSCLC组织标本中,共有45例被观察到存在HSF1的高表达,占总人数的42.9%；高MVD表达组共有49例,占总人数的46.7%。HSF1蛋白表达与MVD之间具有显著的统计学意义(P=0.005)。HSF1蛋白与患者的淋巴结转移、TNM分期之间有显著的统计学相关性(P=0.005；P=0.006)；与其它临床病理指标无统计学意义(P>0.05)。MVD与患者的TNM分期在统计学上密切相关(P=0.019)；与其它临床病理指标无统计相关性(P>0.05)。HSF1蛋白过表达和高MVD组患者的术后复查、远处转移的发生率均分别明显要高于HSF1蛋白非过表达组(P=0.011；P=0.003)以及低MVD组患者(P=0.028；P=0.019)。Log-rank生存差异分析中,HSF1蛋白过表达组患者术后5年总体生存率、疾病特异性生存率以及无病生存率均明显低于HSF1蛋白低表达(P=0.006；P=0.005；P=0.001)。同样地,与低MVD组相比,高MVD组患者分别有一个更差的术后5年总体生存率、疾病特异性生存率以及无病生存率(P=0.019；P=0.016；P=0.006)。Cox多因素回归分析法显示,HSF1蛋白是唯一能够影响NSCLC患者术后5年总体生存率、疾病特异性生存率以及无病生存率的独立预后因素(P=0.040；P=0.046；P=0.004)。结论HSF1蛋白过表达普遍存在于NSCLC组织中,并且与肿瘤微血管生成呈密切相关；与HSF1低表达组相比较,HSF1过表达组的NSCLC患者有一个更加低的术后生存率；HSF1是能够影响患者预后的独立危险因素；在NSCLC患者抗血管生成治疗中,HSF1蛋白可能会成为一个潜在的治疗靶点以及新的预后指标。第二部分：HSFl蛋白表达与非小细胞肺癌侵袭、转移及相关机制的研究目的检测NSCLC组织、细胞中HSF1、CXCR4蛋白及mRNA的表达水平,结合相关临床资料评估二者之间的统计学相关性；通过体外实验研究HSF1蛋白表达对NSCLC细胞的增殖、黏附、血管生成、侵袭、转移等能力的影响,探讨其中涉及的相关分子机制。方法用以实验的105例NSCLC患者的病理标本同第一部分一致。免疫组织化学染色法被用来检测NSCLC病理组织切片中HSF1及CXCR4的表达水平,通过统计学软件处理数据,卡方检验被用来统计分析HSF1、CXCR4之间的关系；Spearman相关性分析二者之间的相关性；Mann-Whitney U检验HSF1高、低表达组中CXCR4的差异性表达,P<0.05被视为有统计学差异性。通过Western blot以及RT-PCR实验分别在蛋白和mRNA水平检测A549、H1975、SPCA等不同的NSCLC细胞系以及正常支气管上皮细胞系BEAS2B中HSF1、CXCR4的表达情况。通过脂质体2000作为载体转染细胞,将特异性沉默HSF1基因的siRNA转入到高表达HSF1的NSCLC细胞系中。流式细胞技术检测各不同处理组中细胞膜上CXCR4的表达水平；MTS实验检测经过不同处理NSCLC细胞系的增殖能力；Transwell实验检测经不同处理的NSCLC细胞系的侵袭能力；通过静止粘附实验模拟检测各不同处理组细胞与细胞外基质、血管内皮细胞的粘附能力。血管内皮细胞迁移实验检测各条件培养液对内皮细胞迁移的影响；酶联免疫吸附实验(enzyme linked-immunosorbent assay, ELISA)检测各条件培养液中VEGF的表达水平；对NSCLC细胞应用CXCR4特异性抑制剂AMD3100以及P13K特异性抑制剂LY294002进行不同处理,RT-PCR和Western blot检测各处理组细胞中VEGF、Akt、P-Akt的不同表达水平；凝胶酶谱实验检测各处理组细胞外培养液中MMP-9的活力强弱。结果HSF1、CXCR4蛋白二者均普遍高表达于NSCLC组织中。卡方检验结果显示HSF1与CXCR4的表达之间有显著地统计学意义(P=0.001)；Spearman相关性分析结果显示R=0.376,二者具有正相关性(P=0.01)。Mann-Whitney U检验也表明,相对于HSF1蛋白低表达组,HSF1蛋白高表达组的NSCLC组织中有更高的CXCR4表达(P<0.05)。细胞实验显示HSF1在各NSCLC细胞系中的表达均明显高于正常上皮细胞BEAS2B,其中SPCA细胞系中表达最高。经脂质体转染HSF1特异性的干扰RNA可以显著降低SPCA细胞中HSF1的表达。Western blot、RT-PCR以及流式细胞检测结果表明HSF1可以促进细胞中及细胞膜上CXCR4蛋白的表达。HSF1干扰组肿瘤细胞在增殖能力、侵袭力、细胞外基质黏附以及内皮细胞黏附力上均明显低于对照组。血管内皮细胞迁移实验显示干扰组细胞外培养液对内皮细胞的迁移能力的影响明显低于对照组,表明干扰组有一个低的血管生成能力；ELISA实验进一步显示干扰组细胞外培养液中VEGF蛋白水平低于对照组；凝胶酶谱实验显示HSF1干扰组细胞外培养液中MMP-9水平明显降低；加入SDF-1α后可以提高各实验处理组结果；加入P13K特异性抑制剂LY294002后显著降低了实验结果；表明SDF-1α/CXCR4轴在HSF1在NSCLC细胞进展的过程中发挥了重要的作用。HSF1可以促进Akt的磷酸化；LY294002降低了SDF-1α及HSF1高表达对NSCLC细胞系的影响,VEGF、MMP-9的表达量也被明显抑制。综上所述,本实验证实了HSF1可以通过SDF-1α/CXCR4轴的介导从而影响Akt的磷酸化水平,促进VEGF、MMP-9等蛋白的表达,进一步影响NSCLC的生物学行为。结论HSF1、CXCR4蛋白在NSCLC组织中均普遍存在高表达,二者之间具有显著的统计学相关性。HSF1过表达能够明显提高NSCLC细胞中CXCR4的表达以及增殖、黏附、侵袭以及血管生成能力。HSF1蛋白通过SDF-1α/CXCR4轴进而激活下游的PI3K/Akt信号通路,通过上调节VEGF、MMP-9等的表达来提高NSCLC的血管生成及侵袭、转移能力。