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本文主要从以下几部分进行论述:
第一部分 肝门部胆管癌病理特征与核糖体蛋白表达分析及其临床意义
目的:
检测核糖体蛋白在人pCCA中的表达谱系，并统计分析其与临床病理参数以及复发和预后的相关性，初步探寻核糖体蛋白在人pCCA发生发展中的潜在意义。
方法:
收集肝门部胆管癌以及部分癌旁非肿瘤性样本，首先从形态学观察肝门部胆管癌的病理特征;其次收集新鲜肝门部胆管癌样本，RT-PCR检测RPs家族成员在肿瘤样本中的表达谱系情况;然后采用组织芯片(tissue microarray，TMA)技术结合免疫组化（immunohistochemistry，IHC）技术，从蛋白水平针对RPL34蛋白检测其在pCCA细胞和癌旁非肿瘤组织中的表达;进而总结分析统计染色结果，并与临床病理信息、复发以及总生存时间相关联，探寻RPL34在人肝门部胆管癌中的表达和临床价值。
结果:
(1)肝门部胆管癌的临床病理学分析:肿瘤细胞呈不规则腺管样排列，可见筛状结构，浸润性生长。肿瘤细胞核异型明显，可见核仁，核分裂像或病理性核分裂像多见。间质可见明显的促结缔组织反应。本研究中94例(77.7％)组织样本中存在神经侵犯，27例(22.3％)患者组织样本中未见明显的神经侵犯，PNI更常见于伴有淋巴结转移和晚期肝门部胆管癌患者。
(2)RPs家族成员在肝门部胆管癌中表达均出现不同程度的上调，提示该家族主要成员在肝门部胆管癌发生中可能起重要的作用。其中RPSA(P=0.0266)、RPS2(P=0.0309)、RPL34(P=0.0034)、RPL37(P=0.0584)、RPP0(P=0.0345)在肿瘤组织中的表达要明显高于癌旁非肿瘤组织中的表达，RPL34最为显著。
(3)在pCCA癌旁非肿瘤上皮细胞中RPL34不表达或呈微弱表达，pCCA肿瘤组织中RPL34染色定位于细胞浆和细胞核，呈棕黄色或深褐色。RPL34在pCCA肿瘤组织中表达率为77.7％(94/121)。
(4)pCCA肿瘤细胞中RPL34表达与肿瘤细胞分化不良和淋巴结转移高度相关。主要表现为:肿瘤细胞的分化程度越低，RPL34表达越高;低分化组的阳性率(82％)要显著高于中、高分化组(30％)(P=0.001）。RPL34表达与淋巴结的转移率呈正相关（淋巴结转移阳性组vs淋巴结转移阴性组为84.6％vs69.6％，P=0.049）。RPL34阳性与患者年龄、性别、肿瘤体积以及临床分期均没有统计学关联（P＞0.05）。
(5)单因素分析显示，边缘阳性(P=0.024)、区域淋巴结(P=0.015)、晚期(P=0.023)与pCCA肿瘤复发相关。与RPL34阴性表达的患者相比，RPL34阳性的患者中位无复发生存期更短(1.46年vs3.73年，P＜0.001)。在Cox模型中，RPL34表达是肿瘤复发的独立预测因素。在多因素模型中，RPL34表达和TSR是肝门部胆管癌的独立预后预测因子。
结论:
肝门部胆管癌具有显著异常的TSR和PNI，两者均与pCCA的淋巴结转移和疾病进展迅速相关。RPs在pCCA中泛化表达，提示核糖体生物发生在肝门部胆管癌发生发展中起到重要作用。RPL34在pCCA中高表达，其表达与疾病进展和淋巴结转移相关，RPL34的高表达患者更加易于复发，并伴随不良转归。本研究结果提示了RPL34在肝门部胆管癌中具有促癌的作用。
第二部分 核糖体蛋白RPL34对肝门部胆管癌细胞侵袭生长的影响
目的:
为探索RPL34在肝门部胆管癌中的促癌作用及机制，观察其对癌细胞增殖、侵袭和体内成瘤及转移能力的影响。
方法:
合成RPL34-shRNA，包装慢病毒颗粒，靶向肝门部胆管癌细胞内源性RPL34，Western blotting检测RPL34的表达，CCK8法观察其对pCCA细胞增殖的影响，Transwell检测RPL34-shRNA对pCCA细胞侵袭能力的改变，裸鼠成瘤实验观察RPL34-shRNA对pCCA细胞体内成瘤和转移能力的影响。
结果:
慢病毒载体携带shRNA成功对RPL34基因进行敲减，内源性RPL34的下降表达能够抑制肝门部胆管癌细胞的生长和迁移能力，同时也能够降低肿瘤细胞的体内成瘤能力以及向肝脏转移能力。
结论:
在肝门部胆管癌中RPL34可能起到促癌基因的功能，其促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长，主要通过增强pCCA细胞转移和增殖能力。
第三部分 核糖体蛋白RPL34促肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用机制
目的:
应用基因芯片检测RPL34-shRNA感染敲减RPL34的肝门部胆管癌细胞QBC939与对照胆管癌细胞的基因表达差异，初步探寻RPL34促进肿瘤侵袭生长的分子机制。
方法:
(1)Western blotting检测RPL34-shRNA感染后部分EMT相关指标和代谢相关指标的表达;(2)收集感染空白对照的肝门部胆管癌细胞和感染RPL34-shRNA的肝门部胆管癌细胞，Trizol保存，送至基因检测平台;(3)利用Affymetrix(R)人类基因组U219微阵列检测感染RPL34-shRNA后基因表达的改变情况。Gene ontology和KEGG通路分析确定基因敲减后影响的信号通路和/或基因;(4)选择部分关键基因，进行Western blotting验证、利用TMA+IHC进行临床验证和统计分析;(5)构建了全长BCAS2(breast carcinoma amplified sequence2)的质粒，并在RPL34敲减细胞中过表达BCAS2，采用CCK8检测细胞增殖、Transwell检测侵袭能力的改变。
结果:
(1)RPL34敲减后引起E-cadherin的表达上调，提示RPL34可能通过影响EMT促进肝门部胆管癌细胞的侵袭。而代谢相关指标未发生明显变化。
(2)基因芯片结果显示160个基因在敲减内源性RPL34后发生显著改变。功能分类显示排名前八位的信号通路分别是:钾离子跨膜运输、核小体组装、心脏传导、细胞蛋白质代谢过程、蛋白质分解代谢、非同源端接双链修复、通过端粒酶端粒维持和信使RNA剪接等。前5位下调差异基因包括:SETD2(SET domain containing2)(Fold change=-2.20,P=0.043)、COA6(cytochrome c oxidase assembly factor6)(Fold change=-2.05,P=0.035)、TSEN15(tRNA splicing endonuclease subunit15)(Fold change=-1.94,P=0.011)、BCAS2(breast carcinoma amplified sequence2)(Fold change=-1.94,P=0.039)和HNRNPLL(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-like)(Fold change=-1.92,P=0.00029)。经过生物信息学分析，发现BCAS2和HNRNPLL两个基因与肿瘤相关。
(3)RPL34调控蛋白BCAS2定位于细胞核和细胞浆，在非肿瘤上皮中呈弱表达，在肿瘤组织中呈强表达，肿瘤中的表达率为76.0％(92/121)。其表达与肿瘤分化呈正相关。与BCAS2阴性的患者相比，BCAS2阳性的患者中位无复发生存期更短(1.69年vs3.14年，P=0.012)。
(4)敲减RPL34后肝门部胆管癌细胞的侵袭生长能力下降，当过表达BCAS2后，癌细胞的侵袭生长能力有所恢复。提示BCAS2能够部分逆转RPL34敲减所致的异常生物学行为。
结论:本部分研究从机制上初步揭示了RPL34促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的潜在机制:RPL34可能通过EMT促进肿瘤侵袭生长;RPL34敲减后基因分析结果提示RPL34通过影响细胞核的翻译、转录、剪切和组装等功能，增强肝门部胆管癌细胞侵袭生长能力;基因芯片筛选出的RPL34相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达，其阳性表达与肝门部胆管癌的恶性生物学行为和不良预后密切相关，过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞侵袭生长能力的下降，提示RPL34可能通过BCAS2发挥促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用。
总结：
RPL34在肝门部胆管癌中显著高表达，具有促肝门部胆管细胞侵袭生长作用。基因芯片检测、生物信息分析和蛋白免疫印迹验证提示RPL34可能通过EMT以及多种信号传导通路促进肝门部胆管癌的侵袭生长。高通量筛选所发现相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达，过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞增殖能力和侵袭能力的下降，提示BCAS2是RPL34可能的下游分子。RPL34有望成为一种预测肝门部胆管癌复发和预后的肿瘤标志物，靶向RPL34介导的信号通路可能成为pCCA潜在的治疗策略。
第一部分 肝门部胆管癌病理特征与核糖体蛋白表达分析及其临床意义
目的:
检测核糖体蛋白在人pCCA中的表达谱系，并统计分析其与临床病理参数以及复发和预后的相关性，初步探寻核糖体蛋白在人pCCA发生发展中的潜在意义。
方法:
收集肝门部胆管癌以及部分癌旁非肿瘤性样本，首先从形态学观察肝门部胆管癌的病理特征;其次收集新鲜肝门部胆管癌样本，RT-PCR检测RPs家族成员在肿瘤样本中的表达谱系情况;然后采用组织芯片(tissue microarray，TMA)技术结合免疫组化（immunohistochemistry，IHC）技术，从蛋白水平针对RPL34蛋白检测其在pCCA细胞和癌旁非肿瘤组织中的表达;进而总结分析统计染色结果，并与临床病理信息、复发以及总生存时间相关联，探寻RPL34在人肝门部胆管癌中的表达和临床价值。
结果:
(1)肝门部胆管癌的临床病理学分析:肿瘤细胞呈不规则腺管样排列，可见筛状结构，浸润性生长。肿瘤细胞核异型明显，可见核仁，核分裂像或病理性核分裂像多见。间质可见明显的促结缔组织反应。本研究中94例(77.7％)组织样本中存在神经侵犯，27例(22.3％)患者组织样本中未见明显的神经侵犯，PNI更常见于伴有淋巴结转移和晚期肝门部胆管癌患者。
(2)RPs家族成员在肝门部胆管癌中表达均出现不同程度的上调，提示该家族主要成员在肝门部胆管癌发生中可能起重要的作用。其中RPSA(P=0.0266)、RPS2(P=0.0309)、RPL34(P=0.0034)、RPL37(P=0.0584)、RPP0(P=0.0345)在肿瘤组织中的表达要明显高于癌旁非肿瘤组织中的表达，RPL34最为显著。
(3)在pCCA癌旁非肿瘤上皮细胞中RPL34不表达或呈微弱表达，pCCA肿瘤组织中RPL34染色定位于细胞浆和细胞核，呈棕黄色或深褐色。RPL34在pCCA肿瘤组织中表达率为77.7％(94/121)。
(4)pCCA肿瘤细胞中RPL34表达与肿瘤细胞分化不良和淋巴结转移高度相关。主要表现为:肿瘤细胞的分化程度越低，RPL34表达越高;低分化组的阳性率(82％)要显著高于中、高分化组(30％)(P=0.001）。RPL34表达与淋巴结的转移率呈正相关（淋巴结转移阳性组vs淋巴结转移阴性组为84.6％vs69.6％，P=0.049）。RPL34阳性与患者年龄、性别、肿瘤体积以及临床分期均没有统计学关联（P＞0.05）。
(5)单因素分析显示，边缘阳性(P=0.024)、区域淋巴结(P=0.015)、晚期(P=0.023)与pCCA肿瘤复发相关。与RPL34阴性表达的患者相比，RPL34阳性的患者中位无复发生存期更短(1.46年vs3.73年，P＜0.001)。在Cox模型中，RPL34表达是肿瘤复发的独立预测因素。在多因素模型中，RPL34表达和TSR是肝门部胆管癌的独立预后预测因子。
结论:
肝门部胆管癌具有显著异常的TSR和PNI，两者均与pCCA的淋巴结转移和疾病进展迅速相关。RPs在pCCA中泛化表达，提示核糖体生物发生在肝门部胆管癌发生发展中起到重要作用。RPL34在pCCA中高表达，其表达与疾病进展和淋巴结转移相关，RPL34的高表达患者更加易于复发，并伴随不良转归。本研究结果提示了RPL34在肝门部胆管癌中具有促癌的作用。
第二部分 核糖体蛋白RPL34对肝门部胆管癌细胞侵袭生长的影响
目的:
为探索RPL34在肝门部胆管癌中的促癌作用及机制，观察其对癌细胞增殖、侵袭和体内成瘤及转移能力的影响。
方法:
合成RPL34-shRNA，包装慢病毒颗粒，靶向肝门部胆管癌细胞内源性RPL34，Western blotting检测RPL34的表达，CCK8法观察其对pCCA细胞增殖的影响，Transwell检测RPL34-shRNA对pCCA细胞侵袭能力的改变，裸鼠成瘤实验观察RPL34-shRNA对pCCA细胞体内成瘤和转移能力的影响。
结果:
慢病毒载体携带shRNA成功对RPL34基因进行敲减，内源性RPL34的下降表达能够抑制肝门部胆管癌细胞的生长和迁移能力，同时也能够降低肿瘤细胞的体内成瘤能力以及向肝脏转移能力。
结论:
在肝门部胆管癌中RPL34可能起到促癌基因的功能，其促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长，主要通过增强pCCA细胞转移和增殖能力。
第三部分 核糖体蛋白RPL34促肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用机制
目的:
应用基因芯片检测RPL34-shRNA感染敲减RPL34的肝门部胆管癌细胞QBC939与对照胆管癌细胞的基因表达差异，初步探寻RPL34促进肿瘤侵袭生长的分子机制。
方法:
(1)Western blotting检测RPL34-shRNA感染后部分EMT相关指标和代谢相关指标的表达;(2)收集感染空白对照的肝门部胆管癌细胞和感染RPL34-shRNA的肝门部胆管癌细胞，Trizol保存，送至基因检测平台;(3)利用Affymetrix(R)人类基因组U219微阵列检测感染RPL34-shRNA后基因表达的改变情况。Gene ontology和KEGG通路分析确定基因敲减后影响的信号通路和/或基因;(4)选择部分关键基因，进行Western blotting验证、利用TMA+IHC进行临床验证和统计分析;(5)构建了全长BCAS2(breast carcinoma amplified sequence2)的质粒，并在RPL34敲减细胞中过表达BCAS2，采用CCK8检测细胞增殖、Transwell检测侵袭能力的改变。
结果:
(1)RPL34敲减后引起E-cadherin的表达上调，提示RPL34可能通过影响EMT促进肝门部胆管癌细胞的侵袭。而代谢相关指标未发生明显变化。
(2)基因芯片结果显示160个基因在敲减内源性RPL34后发生显著改变。功能分类显示排名前八位的信号通路分别是:钾离子跨膜运输、核小体组装、心脏传导、细胞蛋白质代谢过程、蛋白质分解代谢、非同源端接双链修复、通过端粒酶端粒维持和信使RNA剪接等。前5位下调差异基因包括:SETD2(SET domain containing2)(Fold change=-2.20,P=0.043)、COA6(cytochrome c oxidase assembly factor6)(Fold change=-2.05,P=0.035)、TSEN15(tRNA splicing endonuclease subunit15)(Fold change=-1.94,P=0.011)、BCAS2(breast carcinoma amplified sequence2)(Fold change=-1.94,P=0.039)和HNRNPLL(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-like)(Fold change=-1.92,P=0.00029)。经过生物信息学分析，发现BCAS2和HNRNPLL两个基因与肿瘤相关。
(3)RPL34调控蛋白BCAS2定位于细胞核和细胞浆，在非肿瘤上皮中呈弱表达，在肿瘤组织中呈强表达，肿瘤中的表达率为76.0％(92/121)。其表达与肿瘤分化呈正相关。与BCAS2阴性的患者相比，BCAS2阳性的患者中位无复发生存期更短(1.69年vs3.14年，P=0.012)。
(4)敲减RPL34后肝门部胆管癌细胞的侵袭生长能力下降，当过表达BCAS2后，癌细胞的侵袭生长能力有所恢复。提示BCAS2能够部分逆转RPL34敲减所致的异常生物学行为。
结论:本部分研究从机制上初步揭示了RPL34促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的潜在机制:RPL34可能通过EMT促进肿瘤侵袭生长;RPL34敲减后基因分析结果提示RPL34通过影响细胞核的翻译、转录、剪切和组装等功能，增强肝门部胆管癌细胞侵袭生长能力;基因芯片筛选出的RPL34相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达，其阳性表达与肝门部胆管癌的恶性生物学行为和不良预后密切相关，过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞侵袭生长能力的下降，提示RPL34可能通过BCAS2发挥促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用。
总结：
RPL34在肝门部胆管癌中显著高表达，具有促肝门部胆管细胞侵袭生长作用。基因芯片检测、生物信息分析和蛋白免疫印迹验证提示RPL34可能通过EMT以及多种信号传导通路促进肝门部胆管癌的侵袭生长。高通量筛选所发现相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达，过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞增殖能力和侵袭能力的下降，提示BCAS2是RPL34可能的下游分子。RPL34有望成为一种预测肝门部胆管癌复发和预后的肿瘤标志物，靶向RPL34介导的信号通路可能成为pCCA潜在的治疗策略。