参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)来源于钜蚓科环毛蚓属,是《中华人民共和国药典》2010版“地龙”项下收载的4种原动物之一。因其主产于广东和广西两地,故被称为“广地龙”。由于广地龙疗效确切,药材加工精细讲究而被业内公认为品质最优。地龙性寒、味咸,归肝、脾、膀胱经。具有清热息风、通经络、平喘、利尿之功。主治高热惊痫,气虚两滞,半身不遂,肺热哮喘,小便不利及热痹等症。目前广地龙和地龙药材,大多仍靠野生资源,加上不同环境条件以及采收加工技术等的影响,造成药材质量极不稳定,特别是重金属超标一直难以控制的问题。近年有关文献报道,地龙因其独特的身体结构和生活习性,对重金属有富集动力学特性。本课题在前期研究中发现了参环毛蚓对重金属具有耐受和富集等特性,但对其机制仍不了解。要实现从分子水平上研究其富集机制,首先必须要建立参环毛蚓的细胞培养体系,然后通过对体外蚯蚓细胞在不同重金属环境下基因诱导表达试验,在细胞中检测和确定其重金属富集特定基因的转录和表达,从而在细胞和分子水平上解释其重金属富集机制。为此,本研究拟构建参环毛蚓体细胞原代培养体系,从而获得数量多、一致性高的无菌细胞群体,为实现在细胞和分子水平上所进行的基因研究提供必要的载体；为进一步研究参环毛蚓的重金属富集机制,制定降低或消除广地龙重金属超标的策略提供实验依据。这对于从源头上解决地龙药材重金属超标的问题,促进中药可持续发展,保证临床用药安全有效具有重要意义。为了完成研究任务,本论文主要进行了以下工作。一、文献综述查阅了大量与本研究相关的国内外文献资料,系统地总结了前人的研究成果与存在问题,针对地龙的古代研究现状、现代研究状况、动物细胞培养技术等方面进行了论述,并在此基础上,确定了本论文的研究目标与具体研究内容。二、参环毛蚓细胞原代培养灭菌方法的研究对参环毛蚓细胞的原代培养灭菌方案进行考察,选择最佳灭菌方法,建立参环毛蚓细胞原代培养实验体系。通过4因素和3水平的正交试验法考察不同浓度比例抗生素组合液对参环毛蚓细胞的灭菌效果,比较不同抗生素种类和浓度对参环毛蚓细胞原代培养的影响。结果获得一组灭菌效果最佳的抗生素组合液：200 U/mL青霉素钠+400μg/mL硫酸链霉素+300 U/mL硫酸庆大霉素+5μg/mL两性霉素B,10d污染率为0%,且细胞能保持较好活性,并贴壁生长。结果表明组合式灭菌法是参环毛蚓细胞原代培养的最佳有效灭菌方法,且操作简捷易行。三、参环毛蚓体细胞解离方法的研究对参环毛蚓体细胞解离方法进行考察,选择最佳的细胞解离方法。通过比较机械法(包括组织块法和匀浆法)、酶消化法等不同细胞解离方法对参环毛蚓组织块的解离效果,并对其最佳方法进行优化。结果发现酶消化法比机械法解离细胞效果更好,酶解温度为25℃,酶液组选择1g/L胰蛋白酶+1 g/L胶原酶Ⅰ,酶解时间为30 min,在此酶解条件下获得活性细胞最多,细胞经过培养10d后贴壁良好。结果表明,酶消化法解离参环毛蚓组织块,可以获得足够数量、纯度高、活性好的细胞,为参环毛蚓细胞原代培养体系的构建奠定了坚实的基础。四、参环毛蚓不同部位细胞原代培养的研究对参环毛蚓不同部位的细胞贴壁情况进行比较,筛选增殖较快、活力较强的细胞。通过观察嗉囊细胞、前列腺细胞、血细胞、黄色细胞、肠道细胞、体壁细胞的形态,以便于更好地辩认各部位细胞。比较嗦囊、前列腺、肠道和体壁四个组织的细胞贴壁情况,结果发现嗉囊、前列腺细胞没有增长迹象,体壁和肠道分离细胞培养均有增殖,其中肠道细胞增殖明显,较为容易获得细胞贴壁,接种密度为2×105个/mL,7d后可见贴壁。这一结果不仅使我们认识到研究的突破点应放在肠道细胞培养条件的优化上,而且还坚定了本团队完成参环毛蚓重金属富集机制研究的信心。因为本课题组在前期相关试验中曾发现,肠内壁是参环毛蚓重金属吸收和金属硫蛋白表达的主要部位。肠道细胞的培养成功无疑为实现研究目标提供了重要的支撑条件。五、参环毛蚓肠道上皮细胞培养条件的优化及鉴定本项研究系统考察了肠道上皮细胞培养的细胞浓度、血清浓度、基础培养基种类、培养温度等条件对其离体培养的影响,优化其体外培养条件,并进行细胞种源鉴定。结果表明,肠道上皮细胞最适宜的接种浓度为：2×105、5×105个/mL；培养时以Schneider’s Drosophila Medium为基础培养基,添加血清浓度为13%较为合适；与37℃相比,培养温度为25℃时更适合参环毛蚓细胞的生长。通过透射电镜鉴定其为参环毛蚓肠道上皮细胞。本试验优化了肠道上皮细胞的培养条件,为建立体外细胞模型,研究重金属富集机制奠定了基础。六、参环毛蚓肠上皮细胞重金属镉离子耐受性研究比较肠道上皮细胞在不同重金属镉离子浓度环境中的细胞存活情况,初步探索参环毛蚓肠道上皮细胞对重金属镉离子的耐受性。结果发现,肠道上皮细胞在镉离子浓度为100mg/L的情况下仍然顺利贴壁。结果表明,参环毛蚓肠道上皮细胞比活体能够耐受更高的重金属环境,揭示了肠道上皮细胞的重金属耐受基因表达较为活跃,为今后利用肠道上皮细胞进行MT基因转录调控的研究提供了实验依据。七、结论与展望本论文对参环毛蚓细胞原代培养进行了较为系统的研究,对参环毛蚓体外培养的灭菌方法、细胞解离方法、培养部位、培养条件等进行了深入的考察,初步建立了参环毛蚓原代培养体系,在体外建立其细胞模型,为下一步在细胞中检测和确定其重金属富集特定基因的转录和表达奠定了基础,从而在细胞和分子水平上解释其重金属富集机制。同时,本论文对肠道上皮细胞重金属耐受性进行了研究,发现在细胞水平上参环毛蚓肠道上皮细胞对重金属镉离子有较高的耐受力。今后,对于参环毛蚓重金属富集以及MT蛋白转录调控机制等工作还可做进一步探讨和研究。