前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是中老年男性的恶性肿瘤之一,其死亡率仅低于消化系统和呼吸系统肿瘤。前列腺癌是雄激素依赖性恶性肿瘤,原发性/早期前列腺癌以去势治疗(手术/药物)为首选方案,且有明显效果。但多数患者治疗后1年左右会进展为激素抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC),伴随远端转移、抗药性强。对此临床采用微管靶向药物多西他赛为基础的化疗为主要的治疗方案,也是唯一能够提高转移性CRPC患者生存率的化疗药物。和其它药物一样,经多西他赛化疗后产生的多药耐药(multidrugresistance,MDR)仍不可避免,而且耐药后的CRPC预后差,死亡率高。针对前列腺耐药机制已有很深入的研究,包括细胞膜、细胞质、细胞核以及肿瘤微环境介导的耐药机制,如细胞膜药泵蛋白的异常活化、细胞内药靶β-微管蛋白突变或过表达、PI3K/AKT/mTOR信号通路异常活化、表观遗传学改变、代谢重编程等。针对耐药机制的设计的逆转药物,如卡巴他赛(Cabazitaxel)对药泵蛋白P-gp的亲和力低,是多西他赛耐药后的逆转药物。然而前列腺癌的耐药机制复杂,特异性强的药靶少,有效的逆转方案不多。因此探索前列腺癌耐药的新机制、发现新的有效药靶及逆转药物一直是解决临床需求的重要课题。第一部分基于表达差异谱分析前列腺癌多药耐药细胞代谢改变及其逆转药物的筛选一、前列腺癌低倍数多西他赛诱导多药耐药细胞株的构建PC3和DU145为激素非依赖性前列腺癌细胞,抗凋亡能力较强,恶性程度高。我们根据临床用药的模式,给予PC3和DU145细胞六个周期的多西他赛(Docetaxel,Doc)处理,经过筛选,得到化疗耐受的PC3/Doc和DU145/Doc。耐药指标分析显示,两种耐药细胞株对多西他赛的耐药倍数提高至3.8倍和2.4倍,并对拓扑异构酶Ⅱ靶向药物多柔比星和微管靶向药物长春新碱都产生交叉耐药性,而对DNA损伤药物顺铂的耐药性不显著,表明耐药细胞PC3/Doc和DU145/Doc具有多药耐药特性。二、耐药细胞与亲本细胞的表达差异谱分析1.耐药细胞中代谢相关基因变化最为显著:通过对表达差异谱芯片进行了聚类分析,发现变化最多的差异基因集中于代谢通路。对关键的代谢基因进行分析,发现PC3/Doc耐药细胞中无氧酵解及三羧酸循环氧化脱羧并无显著增强,而三羧酸循环的还原代谢、谷氨酰胺代谢和脂酸合成相关基因的表达都显著增加。表明耐药细胞代谢信号发生改变,其中线粒体代谢的变化具有显著性。2.耐药细胞对谷氨酰胺代谢抑制剂和HDAC抑制剂敏感性增强:通过对8种代谢相关的抑制剂进行逆转耐药活性筛选,和亲本细胞相比,PC3/Doc耐药细胞对谷氨酰胺代谢抑制剂 BPTES(bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadizaol-2-yl)ethyl sulfide)更为敏感,其IC50为3.12μM,亲本细胞PC3为7.50μM;而对糖酵解抑制剂2-DG并无显著应答(IC50为5.87mM vs PC3为2.96mM)。同时发现,耐药细胞对组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂TSA最为敏感,提高了近10倍(其IC50为0.33μM vs PC3细胞为2.87μM)。抑制谷氨酰胺代谢能非常显著抑制耐药细胞的增殖,表明谷氨酰胺代谢在前列腺癌耐药过程中发挥重要作用;同时耐药细胞对HDAC抑制剂有如此显著的应答,表明蛋白的乙酰化也在耐药中扮演重要角色,其机制需要进一步分析。第二部分异常活化的谷氨酰胺代谢促进前列腺癌的多药耐药肿瘤细胞由于Warburg效应,葡萄糖来源的丙酮酸大多通过乳酸脱氢酶而产生乳酸,仅少部分丙酮酸进入三羧酸(TCA)循环。谷氨酰胺代谢可以很好的回补TCA循环的成分。首先谷氨酰胺经转运蛋白如Na+依赖的Solute carrier family 1(neutral amino acid transporter)member5(SLCIA5,也称ASCT2)、L-typeamino acid transporter 1(LAT1)等转入细胞内,经谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)分解后转变为谷氨酸,后者在谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GLUD)的作用下转化为α-酮戊二酸(α-KG),α-KG进入三羧酸循环,实现对TCA循环的回补。因此,增强的谷氨酰胺代谢在肿瘤的恶性转变中通过提供碳源、氮源等而发挥关键性作用:如在葡萄糖匮乏时,通过TCA循环的中间代谢物如草酰乙酸逆向进入糖酵解途径;由此形成的柠檬酸通过穿梭出线粒体而进入细胞质,经ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase,ACLY)分解产生的Acetyl-CoA主要是用于脂质合成、蛋白的乙酰化等。另外,谷氨酰胺分解产生的谷氨酸也用于形成谷胱甘肽(GSH),用于清除胞内自由基。已有研究证实,前列腺癌与其它肿瘤有所不同,更依赖谷氨酰胺代谢和脂代谢,而我们利用生物信息学方法分析多西他赛诱导的多药耐药细胞和亲本细胞的表达差异谱芯片数据时,发现top pathway是代谢相关信号,其中谷氨酰胺代谢相关的基因表达显著增加,同时耐药细胞对GLS抑制剂BPTES敏感性增强。因此我们首先分析谷氨酰胺在前列腺癌耐药中的作用,并取得了以下研究成果:一、谷氨酰胺代谢促进前列腺癌的恶性进展1.前列腺癌耐药细胞的增殖对谷氨酰胺的依赖性增强:肿瘤的复发、转移、耐药等都是恶性转化的表现。我们的结果显示,前列腺癌耐药细胞谷氨酰胺代谢旺盛,谷氨酰胺转运蛋白ASCT2,LAT1都有不同程度的增加,且谷氨酰胺酶的表达和活性都明显升高;细胞培养基撤除谷氨酰胺后,亲本细胞PC3的存活无影响,只呈现出增殖减缓,但是耐药细胞却不增殖,而且存活率逐渐下降。因此,耐药细胞对谷氨酰胺的依赖具有“成瘾性”。2.谷氨酰胺酶的高表达与前列腺癌治疗后复发呈负相关:为了进一步证实谷氨酰胺对前列腺癌恶性表型的影响,我们利用TCGA数据库,分析了 285例经化疗或手术切除的前列腺癌患者的复发情况、以及与ASCT2,LAT1和GLS表达水平间的关联。结果显示,GLS高表达的前列腺癌患者,复发早,其无复发生存期明显低于GLS表达低的患者;但ASCT2和LAT1的表达对其复发无显著差异。因此,谷氨酰胺酶GLS是前列腺癌恶性进展中调控谷氨酰胺代谢的关键酶,具有更为重要的作用。二、抑制谷氨酰胺酶逆转耐药、促进耐药细胞凋亡1.抑制谷氨酰胺酶显著增加耐药细胞对多西他赛的敏感性:鉴于谷氨酰胺酶在耐药细胞中的显著变化,我们利用谷氨酰胺酶抑制剂BPTES检测耐药细胞对其应答情况,MTT结果显示,和亲本细胞相比,耐药细胞对BPTES的敏感性更高,而且低浓度的BPTES就能显著增加耐药细胞对多西他赛的敏感性,二者联用具有协同效应。因此,谷氨酰胺酶在前列腺癌的耐药中发挥重要作用。2.抑制谷氨酰胺酶活性,增加细胞的ROS水平:我们前期发现耐药细胞中ROS水平较亲本细胞低,具有干细胞样特性。BPTES能使细胞内GSH/GSSH比率下降,细胞ROS水平明显升高。3.抑制谷氨酰胺酶促进耐药细胞凋亡:BPTES显著诱导耐药细胞DNA损伤,gamma-H2AX水平增加,PARP的剪切水平增加,促进细胞凋亡。第三部分谷氨酰胺对TCA循环的促进作用增强耐药细胞蛋白的乙酰化并增加对HDAC抑制剂的敏感性我们在筛选耐药细胞的逆转药物时发现,耐药细胞对HDAC抑制剂较亲本细胞更为敏感,其IC50值降低近10倍,因此我们对其抑制机制进行较为细致的研究。由于前列腺癌对谷氨酰胺代谢更为依赖,而谷氨酰胺代谢对TCA循环的回补作用,能促进柠檬酸穿梭至胞质,经柠檬酸裂解酶ACLY分解产生Acetyl-CoA,用于合成脂肪酸。同时,Acetyl-CoA通过乙酰转移酶介导蛋白乙酰化,是组蛋白、非组蛋白乙酰化必不可少的基团,而HDAC抑制剂使蛋白的乙酰化水平增加,细胞对Acetyl-CoA的需求增加。因此,我们推测,耐药细胞对HDAC抑制剂的应答可能与Acetyl-CoA、蛋白乙酰化有关,与染色体的表观遗传调控作用有关。一、前列腺癌耐药细胞中蛋白的乙酰化水平显著增加1.前列腺癌耐药细胞中总蛋白的乙酰化水平增加:我们首先通过蛋白印迹分析亲本细胞与耐药细胞蛋白乙酰化水平的差异,结果显示,耐药细胞组蛋白H3、H4的乙酰化水平、非组蛋白的乙酰化水平都显著增加。我们利用前列腺癌DU145细胞及多西他赛诱导构建耐药细胞DU145/Doc,western blotting结果显示,耐药细胞中总蛋白和组蛋白的乙酰化水平也显著增加。2.耐药细胞乙酰化水平变化可能与药物类型有关:为了分析耐药细胞乙酰化水平的变化是否与肿瘤类型、药物种类有关,我们利用肺癌H460细胞以及紫杉醇诱导的耐药H460/RT细胞、口腔上皮细胞癌KB细胞及由长春新碱诱导的耐药细胞KB/VCR、食管癌细胞EC109及由顺铂诱导的耐药细胞EC109/CDDP进一步进行分析,western blotting结果显示,耐药细胞KB/VCR呈现蛋白乙酰化水平增加,而H460/RT和EC109/CDDP细胞蛋白乙酰化水平和其亲本细胞并无显著差异。表明乙酰化状态的改变可能与肿瘤的类型无关,而与药物类型有关,但仍需进一步证实。二、谷氨酰胺代谢提高耐药细胞胞质和核中的Acetyl-CoA1.前列腺癌耐药细胞的胞质中含有较高水平的Acetyl-CoA:由于组蛋白和非组蛋白在耐药细胞中的乙酰化水平都显著增加,我们利用超速离心法分离出前列腺癌PC3/Doc耐药细胞线粒体和胞核组分,并分析其Acetyl-CoA的含量,结果显示,耐药细胞胞质和核中的Acetyl-CoA远高于亲代细胞,而且耐药细胞经TSA处理后,蛋白的乙酰化水平更加显著提高,细胞对Acetyl-CoA的需求显著增加,Acetyl-CoA在胞质和核中的含量显著下降。2.前列腺癌耐药细胞柠檬酸裂解酶等活性增加:胞质和核中Acetyl-CoA的含量需要胞质中ATP依赖的柠檬酸裂解酶ACYL,结果显示,耐药细胞中ACYL显著高于其亲本细胞;同时,乙酰辅酶A羧化酶Acetyl-CoA carboxylase(ACC)在耐药细胞中表达也显著增加,表明脂代谢增强。因此,耐药细胞谷氨酰胺代谢对TCA循环的回补作用,提供了充足的Acetyl-CoA,除了促进脂代谢外,还使组蛋白的乙酰化水平增加、进而促进染色质的转录。三、耐药细胞的乙酰化水平影响其对HDAC抑制剂的敏感性1.高乙酰化水平的耐药细胞对HDAC抑制剂的敏感性增强:我们采用MTT方法分析不同耐药细胞对HDAC抑制剂TSA的应答,结果显示,总蛋白乙酰化水平升高的耐药细胞DU145/Doc和KB/VCR对TSA均有显著应答,而耐药细胞H460/RT和EC109/CDDP的乙酰化水平与亲本细胞并无显著差异,其对TSA的应答也相近。同样,另一种HDAC抑制剂SAHA对前列腺癌耐药细胞的作用也具有相似的结果。2.TSA进一步增强耐药细胞的蛋白乙酰化:Western blotting结果显示,TSA处理30min就能显著增加前列腺癌耐药细胞PC3/Doc总蛋白和组蛋白的乙酰化,且随作用时间的延长而进一步增加,具有时间依赖性。另外,TSA在处理后1h就显著增加耐药细胞组蛋白H3K9、H4K16的乙酰化,并随作用时间的延长使其保持在高乙酰化状态;耐药小鼠经TSA处理后,其瘤组织中H3K9、H4K16的乙酰化水平显著增加,多西他赛处理后也使其乙酰化略有增加。表明HDAC抑制剂可同时促进组蛋白和非组蛋白的乙酰化。四、前列腺癌耐药细胞中HDAC和MOF活性增加1.耐药细胞HDAC5表达增加:由于耐药细胞对HDAC抑制剂敏感,我们进一步分析耐药细胞中HDAC的表达水平,wertern blotting结果显示,和亲本细胞PC3相比,耐药细胞中HDAC5的表达增加,而HDAC1、HDAC2、HDAC4、HDAC6均无明显变化;我们随后利用HDAC5特异性的siRNA下调其表达并分析其对药物应答的影响,MTT结果显示,下调HDAC5后,耐药细胞对多西他赛的敏感性并无改变。因此,HDAC5在耐药细胞中并无显著作用。2.TSA抑制耐药细胞HDACs的活性:耐药细胞经TSA处理后,各种HDAC的表达均无显著下调。我们进一步分析其酶的活性,结果显示,耐药细胞中总的HDAC活性显著增加,经TSA处理后,显著抑制HDACs酶的活性,表明TSA抑制耐药细胞HDACs活性,对其表达并无显著影响。但是,HDAC活性增加会导致组蛋白的乙酰化水平降低,提示,耐药细胞的高乙酰化水平可能有其他机制。3.耐药细胞乙酰转移酶的表达增加:蛋白的乙酰化受HDAC和乙酰转移酶双重调节,由于耐药细胞组蛋白H3K9、H4K16的乙酰化水平增加,我们又分析与其相关的乙酰转移酶p300和MOF的表达水平,结果显示,耐药细胞中MOF高表达,而p300的表达并无显著增加,表明乙酰转移酶MOF可能参与提高耐药细胞乙酰化水平,其机制需进一步研究。五、HDAC抑制剂通过强化内质网应激而促进耐药细胞凋亡1.TSA显著诱导耐药细胞凋亡:EdU掺入实验显示,0.1μM TSA显著抑制耐药细胞PC3/Doc增殖,但同一浓度下对PC3细胞的抑制作用极低;0.2μM TSA能够引起caspase活化和PARP的剪切,并随TSA浓度的增加而持续升高。1μM TSA也并没有引起PC3细胞PARP的剪切和凋亡的发生。2.TSA显著诱导内质网应激:内质网应激的感应蛋白GRP78,在TSA处理1小时出现并于9h后表达增加。p-PERK在3小时开始增加。此外,TSA处理18时内质网凋亡相关蛋白ATF3和CHOP/GADD153明显升高。以上结果表明TSA诱发的内质网应激引发了后期内质网凋亡相关蛋白表达的增强。3.抑制基因表达显著逆转TSA的促凋亡作用:蛋白质合成抑制剂CHX或转录抑制剂ActD预处理2h,CHX能够显著逆转TSA诱导的细胞死亡,抑制caspase-3激活和PARP剪切。4.TSA显著增加应激基因的转录:ChIP实验,通过Ac-H4K16抗体与PCR检测,显示HSP5和ATF4启动子上Ac-H4K16增加(HSP5为GRP78基因编码)。5.TSA激活PI3K/Akt存活通路,加剧内质网应激:TSA短时间能激活了 AKT通路。短时间观察发现,AKT/mTOR的活化早于应激感应蛋白GRP78的变化。AKT/mTOR的抑制剂能够降低内质网应激的发生。6.低剂量TSA显著抑制耐药荷瘤小鼠的肿瘤生长:TSA处理组肿瘤体积显著减小(538.57±349.56mm3),抑制率为61.3%,且TSA明显抑制耐药细胞增殖(TSA组 10.79±3.22%vs 对照组 35.43±5.40%)。第四部分结论、创新点和不足之处一、结论1.前列腺癌耐药细胞中谷氨酰胺代谢和脂酸合成代谢旺盛,线粒体代谢旺盛。且谷氨酰胺酶在耐药过程中发挥更为重要的作用。2.耐药细胞的增殖高度依赖于谷氨酰胺,而谷氨酰胺酶抑制剂BPTES显著抑制耐药细胞的增殖,低浓度的BPTES显著增加耐药细胞对多西他赛的敏感性。3.谷氨酰胺酶抑制剂BPTES通过诱导耐药细胞ROS、促进DNA损伤而诱导耐药细胞凋亡。4.耐药细胞旺盛的谷氨酰胺代谢,提高对TCA循环的回补作用,和亲本细胞相比,耐药细胞柠檬酸裂解酶等活性增加,促进胞质和核中Acetyl-CoA的含量显著增加,而在线粒体中的含量略有下调。5.胞质和核中高水平的Acetyl-CoA促进脂代谢,增加耐药细胞的组蛋白、非组蛋白的乙酰化水平。6.耐药细胞中乙酰转移酶如MOF的水平增加促进组蛋白及总蛋白的乙酰化,而耐药细胞高活性的HDAC可能对蛋白的乙酰化并无显著作用。7.具有高乙酰化状态的耐药细胞对HDAC抑制剂敏感性增强;耐药细胞的乙酰化水平可能与药物类型有关。8.HDAC抑制剂在短时间内通过激活PI3K/Akt信号、促进蛋白合成,同时促进组蛋白H3K9、H4K16的乙酰化,促进应激基因的转录,最终加剧内质网应激,导致耐药细胞发生凋亡。二、创新点1.首次报道谷氨酰胺酶参与前列腺癌耐药,并发现低剂量BPTES显著增加耐药细胞对多西他赛的敏感性,二者联用具有协同效应。2.首次报道前列腺癌耐药细胞对HDAC敏感性受总蛋白乙酰化水平及HDAC活性的影响。3.首次报道HDAC抑制剂通过激活AKT通路强化内质网应激而促进前列腺耐药细胞凋亡。三、不足之处1.多西他赛介导耐药细胞发生代谢重编程的机制尚需进一步探讨。2.多西他赛对谷氨酰胺酶调节机制、谷氨酰胺酶在耐药中对乙酰辅酶A的含量、细胞定位机制还需进一步分析。3.谷氨酰胺酶在耐药中的作用、对多西他赛的增敏作用尚需动物药效学实验进行验证。4.耐药细胞乙酰化水平增加的机制尚需细致分析。