番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)主要侵害10日龄的雏番鸭,可以在受感染的雏鸭群体中持续到6周龄,且有10%到50%的发病率。前期研究发现MDRV可引起宿主细胞凋亡,但是关于其诱导凋亡的分子机理仍然需要进一步研究。MDRV-S4片段为双顺反子基因,其互相重叠的两个开放阅读框分别编码p10.8和σC蛋白。ARV σC可诱导机体产生中和抗体,并引起细胞凋亡,而MDRV的研究中发现可引起细胞凋亡的是p10.8蛋白,但其凋亡机制尚不清楚,且σC具有什么生物学功能有待进一步研究。阐明MDRV p10.8及σC的生物学功能,对于阐明MDRV的分子致病机理具有重要的意义。因此,本研究选择DF-1细胞为模式细胞,探讨MDRV p10.8及σC蛋白的生物学功能,为深入阐释MDRV S组蛋白功能奠定基础。其主要内容和结果如下:1.MDRV-σC的原核表达及多克隆抗体制备。本试验根据NCBI上的σC基因(Genbank ID:KX831117.1)设计一对特异性引物,PCR扩增出MDRV-σC基因的ORF,将其克隆到表达载体pET-32a(+)上构建pET-32a-σC重组质粒。经过PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定结果表明,pET-32a-σC重组质粒构建正确。然后将pET-32a-σC重组质粒转入BL21(DE3)化学感受态细胞中表达,western blot方法验证表达蛋白的正确性。然后优化pET-32a-σC重组蛋白的诱导表达条件。结果表明,诱导表达条件为37℃,1 mMIPTG诱导4h表达效果最好。用Ni-NTAResin纯化方法纯化重组蛋白,结果表明,400 mM的咪唑浓度洗脱重组蛋白纯化效果较好。将纯化后的蛋白按照免疫程序免疫新西兰兔,四免后采血分离血清,ELISA检测抗体效价水平达 1:640000。2.MDRV-σC蛋白的生物学功能研究。本实验构建真核表达载体,应用PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定,鉴定重组质粒构建结果的正确性,并利用制备的多克隆抗体对其进行western blot鉴定,保证表达蛋白的正确性。σC转染DF-1细胞后,对表达蛋白进行亚细胞定位,并应用流式细胞技术检测细胞凋亡、细胞坏死及细胞周期的情况,及荧光定量PCR技术检测CDK2、cyclin E、cIAP及MLKL基因的表达水平。定位结果表明,σC蛋白不进入细胞核,主要集中在细胞质中。流式细胞术结果显示,σC蛋白能够阻滞DF1细胞于G1期,其主要是通过下调细胞周期关键基因CDK2及cyclin E表达来调节的,可见σC蛋白可调控DF-1细胞于G0/G1期。细胞凋亡及坏死检测结果说明,σC蛋白不诱导DF-1细胞发生早期凋亡,但是荧光定量PCR检测结果表明,σC蛋白转染DF1细胞可上调程序性坏死的执行蛋白MLKL基因的表达,并上调细胞凋亡抑制蛋白cIAP的表达,由此推测,σC蛋白可引起细胞发生程序性坏死。3.MDRV-p10.8蛋白诱导DF-1细胞内质网应激、凋亡的研究。本试验利用实验室保存的MDRV-p10.8重组表达质粒,转染DF1细胞24小时,检测内质网应激标志基因xbp-1和ATF6,凋亡关键蛋白CHOP及caspase3的mRNA表达,同时,通过添加内质网应激激活剂和抑制剂,实时荧光定量PCR检测内质网应激标记基因xbp-1和ATF6,凋亡关键蛋白CHOP及caspase3的mRNA表达。结果表明,p10.8上调了 xbp-1、ATF6、CHOP及caspase3的表达。添加抑制剂,xbp-1、ATF6、CHOP及caspase3的表达量与p10.8组比,均显著性下调。而添加激活剂,xbp-1、ATF6、CHOP及caspase3的表达量p10.8组显著性上调比。可见MDRV p10.8蛋白可诱导DF1细胞内质网应激、凋亡。综上所述,本试验成功构建σC原核及真核表达系统,并成功制备了针对σ C蛋白的兔抗多克隆抗体,并可发现MDRVσC蛋白可阻滞DF-1细胞周期于G0/G1期,并引起细胞发生程序性坏死。此外,还发现MDRV p10.8蛋白可诱导DF-1细胞发生内质网应激凋亡。结果为进一步阐明MDRV的致病机理奠定了基础。