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伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种急性接触性传染病,可感染多种动物,死亡率高,幼龄动物的死亡率高达100%。猪是伪狂犬病毒的主要宿主及传播群体,可以通过呼吸道散毒,也可以通过粪便接触而感染,传播范围广、速度快,给我国养猪产业造成巨大的经济损失。国内主要采用注射伪狂犬病毒gE基因缺失的疫苗进行疾病预防。但近些年,由于伪狂犬野毒株存在变异,目前疫苗的防御效果大大降低,伪狂犬病发病情况呈上升趋势。建立能够快速鉴别野毒株和疫苗株的PRV检测方法对于伪狂犬病的防控具有重大意义。本研究针对伪狂犬病毒野毒株主要毒力基因gE和伪狂犬病毒保守基因gB进行引物设计,对PCR反应体系进行优化,建立能够临床应用的PRV双重PCR检测方法。应用双重PCR方法检测临床样本,了解长春地区PRV感染情况。研究内容由以下两个方面组成:1 PRV双重PCR检测方法的建立本研究在单重PCR体系的基础上,将gE引物和gB引物加入同一反应体系中进行gE基因与gB基因片段的同步扩增。应用普通PCR方法进行单引物特异性筛选,优化反应条件建立单重反应体系。在双重PCR反应中,将单重引物混合进行双片段扩增,筛选扩增过程中彼此间不干扰的引物,对体系中酶、dNTP和镁离子的浓度及退火温度分别进行优化,对比单重体系,确定最适反应条件。最终确定25ul反应体系中:酶0.05units/ul,dNTP0.15mM each,镁离子1.5mM,退火温度为60℃时,双重PCR扩增结果最好。通过特异性、敏感性、重复性和符合实验证明建立的双重PCR反应体系特异性高,稳定性好,可扩增出浓度在2.003×10-5ng/ul及以上的DNA,阳性检出率为100%。2 PRV双重PCR检测方法的应用2017年在长春及周边地区的猪场共采集疑似伪狂犬病样品167份,其中2-4月54份,5-7月26份,8-10月70份,11-12月17份。应用双重PCR方法进行检测,测得野毒株阳性结果为58份,野毒感染阳性率为34.73%,其中春季与秋季野毒感染率较高,分别为35.19%和35.71%;冬季感染率最低,为29.41%;夏季为34.62%。长春区域内伪狂犬的发病情况较为严重,四季均能感染,且PRV野毒感染情况呈上升趋势。本研究为之后长春地区猪伪狂犬病的防控提供参考。