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背景HCMV感染在人群中极为普遍,可以长期潜伏在宿主体内,在免疫功能不成熟或缺陷的人群中,HCMV可能被激活而导致严重的疾病甚至死亡。研究发现HCMV的独特结构UL/ b’区域与病毒致病性高度相关,该区域至少包括19个开放阅读框(ORF)(UL133-UL151),目前对此区域转录产物的系统分析尚不充分。本课题组前期研究首次证实UL148等5个基因存在mRNA的表达水平,但其转录本的全基因信息尚未明确。本研究应用RACE技术获取UL148区域基因的转录情况,分析该基因相关转录本信息,以探讨UL148基因可能存在的功能。目的1.通过RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术扩增HCMV病毒株UL148基因相关转录本的cDNA序列;2.应用生物信息学方法对UL148基因相关转录本的全基因序列进行分析;3.初步分析UL148基因编码蛋白的功能,为进一步研究该基因的功能奠定基础。方法1.将HCMV病毒株接种至生长良好的HFF细胞,用显微镜观察细胞病变效应(CPE);2.待细胞出现病变后,取上清液,提取病毒DNA;3.根据HCMV复制的必需基因IE和LA设计引物,应用多重PCR技术鉴定HCMV病毒;4.收集病变细胞,抽提病毒RNA;5.根据已知的部分cDNA序列,分别在其5’和3’端设计特异性引物,与5’RACE和3’RACE接头引物相对应,扩增HCMV病毒株UL148基因的5’和3’末端;6.通过pMD18-T载体作TA克隆,构建5’和3’RACE产物的重组体;5.对重组体进行测序鉴定;7.根据5’RACE和3’RACE结果设计引物;8.应用RT-PCR技术扩增UL148基因的全长cDNA序列,与GenBank上已知病毒株的序列进行比较;9.应用生物信息学技术分析UL148基因的结构,编码蛋白的性质和特征,初步分析UL148基因的生物学功能。结果1. HCMV病毒株感染HFF细胞后,细胞出现典型病变效应;2.应用多重PCR技术扩增IE和LA基因,结果条带大小与预期一致,证明HCMV感染成功。3.抽提病毒RNA后,采用5’和3’RACE技术,成功扩增出UL148基因的5’和3’末端;4.测序结果表明其5’末端长496bp,3’末端长995bp;5.RT-PCR技术扩增UL148基因全长cDNA序列,全长共2442bp,UL148基因和UL132基因共同转录,共用的3’末端包括11个腺苷酸的poly A尾,位于加尾信号下游区域20bp左右;6.生物信息学分析发现:UL148基因转录产物编码蛋白的相对分子量为36.473kD,理论等电点为9.15,为碱性蛋白,分子式是C1664H2585N453O449S11,无内含子序列,开放读码框含有316个氨基酸;7. UL148基因编码蛋白的286～308位氨基酸是跨膜部位,推测其可能是一种跨膜蛋白。结论1.应用RACE技术成功获得HCMV病毒株UL148基因和UL132基因的全长cDNA序列,全长共2442bp;2.从结果推测,UL148基因和UL132基因可能是一个转录本,共用3’末端;3.生物信息学分析表明UL148基因编码蛋白可能是一种跨膜蛋白;4.推测UL148基因可能在HCMV致病方面具有一定的作用。