核因子κB (Nuclear factor kappa B, NF-κB)是一类广泛存在于多种组织细胞中的DNA结合型转录因子。研究发现,当细胞受到刺激(如TNFa, LPS等诱导)时,胞质中的NF-κB被激活,进入细胞核,特异性结合其靶DNA序列,从而调控其靶基因(包括蛋白编码基因与miRNA基因)的表达。大量的研究表明,NF-κB对靶基因的调控是其实现生物学功能的关键步骤；借此步骤,NF-κB在免疫、炎症、肿瘤、衰老等重要生理及病理过程中发挥关键功能。而且,NF-κB本身及其靶基因还为药物筛选及疾病治疗提供重要靶点。因此,鉴定NF-κB的靶基因具有重要的基础研究意义和生物医学应用价值。本课题对TNFa诱导的NF-κB靶基因进行了系统的鉴定研究,取得如下结果：1. NF-κB调控miRNA的表达为了鉴定NF-κB的靶miRNA.本章首先运用高通量技术(ChIP-Seq和miRNA-Seq)在HeLa细胞中研究鉴定14个TNFa诱导的NF-κB靶miRNA,并用ChIP-qPCR和qPCR技术在TNFa刺激的HeLa和HepG2两种细胞中验证此结果。运用miRanda、 miRwalk和DIANA-microT-CDS三款软件共同预测出miRNA的576个靶基因。将这些基因与基因芯片确定的TNFa诱导HeLa细胞中的差异表达基因相比较,鉴定出6个NF-κB靶miRNA, miR-125b-1-3p, miR-1286、 miR-502-5p、 miR-1276、 miR-219-1-3p和miR-30b-3p的16个靶基因。最后运用qPCR技术验证了这些miRNA,如miR-125b-1-3p和miR-1276,在HeLa和HepG2细胞中对其靶基因的调控,如miR1276对CASP9和BMP2基因表达的调控。通过DAVID软件对基因功能的注释,发现BMP2和骨关节炎相关,CASP9和2型糖尿病及肺癌相关,提示目前功能尚不清楚的miR-1276可能通过其靶基因BMP2和CASP9在骨关节炎、2型糖尿病和肺癌中发挥作用。进一步的分析还表明,miR125b-1除了在HeLa和HepG2细胞中受TNFa诱导激活的NF-κB的调控外,还在LPS、IL-1β孢子虫感染和紫外等多种理化因素刺激的多种类型的其他细胞中受NF-κB的调控。此外,该miRNA还能下调NF-κB活化抑制蛋白TNFAIP3的表达,从而在细胞内形成了一信号调控回路。因此,miR125b-1可视为NF-κB通路的“信号传递中心”。总之,本章研究结果为解读NF-κB在其靶miRNA相关的生物学过程中发挥的生物学功能提供了新的线索,有助于揭示这些生物学过程的分子机制。2. NF-κB调控凋亡基因CASP9的表达通常可诱导的DNA结合型转录因子NF-κB发挥抗凋亡作用。但是,最近越来越多的证据表明,在特定条件下NF-κB还可以促进细胞凋亡。然而,介导NF-κB促凋亡作用的靶基因并不完全清楚。在本章中,我们在分析ChIP-Seq数据的基础上,运用生物信息学、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因、qPCR和Western blot等方法,证明促凋亡基因CASP9为TNFa诱导NF-κB上调的靶基因。并在上一章节研究的基础上进一步证明,miR1276为TNFa诱导NF-κB下调的靶miRNA,并且miR1276可下调CASP9基因的表达。因此,在NF-κB、 CASP9和miR1276之间,存在着上调CASP9 表达的信号调控回路。随后,通过荧光显微镜和流式细胞术检测,发现TNFa可促进阿霉素诱导的HeLa和HepG2细胞的凋亡；并且发现TNFa不仅诱导此过程中CASP9总蛋白的表达,而且引起CASP9蛋白的激活。此外,CASP9抑制剂可降低TNFa提高的阿霉素诱导细胞凋亡的能力。这些结果表明,TNFa诱导NF-κB上调并激活的CASP9蛋白,在促进阿霉素诱导的细胞凋亡中发挥关键作用。总之,本章研究发现NF-κB直接或间接上调的CASP9基因表达是NF-κB促凋亡作用的新的介导者,这为洞悉NF-κB的促凋亡功能及其分子机制提供了新的依据。3. NF-κB调控癌症相关基因的表达研究发现,NF-κB通过调控其靶基因,在肿瘤细胞增殖、血管生成和侵袭转移等过程中起重要作用。为了充分解读NF-κB在肿瘤进展中的分子功能,在本实验室曾用ChIP-Seq和基因芯片技术鉴定了TNFa诱导的宫颈癌细胞HeLa中的NF-κB靶基因,本章用基因注释软件DAVID进一步分析了这些靶基因的功能,发现20个靶基因被富集在KEGG的癌症信号通路(Pathways in cancer)中,并且其中16个靶基因被富集在非小细胞肺癌、慢性粒细胞性白血病、基底细胞癌、胰腺癌和结直肠癌等癌症相关KEGG条目中。因此,这20个基因被推断为癌症相关的NF-κB靶基因。初步的分析表明,这20个基因中有些基因为已经报道的NF-κB靶基因。除此之外,本章发现了几个新的癌症相关NF-κB靶基因,如CYCS, MITF, FZD1、 FZD8和PIASl。随后本章通过生物学方法、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因、qPCR及Western blot等方法,在HeLa和HepG2细胞上证实这5个基因为TNFa诱导的NF-κB靶基因。这些研究结果为深入理解NF-κB在肿瘤演进过程中的分子功能奠定了基础。4. NF-κB调控三羧酸循环关键酶基因表达肿瘤细胞代谢重编程是肿瘤的基本特征之一。因此,研究代谢相关的NF-κB靶基因,有助于深入理解该转录因子在肿瘤演进过程中的分子功能。本章通过分析运用ChIP-Seq和基因芯片技术鉴定的TNFα诱导宫颈癌细胞HeLa中的NF-κB靶基因,发现在TNFa刺激的HeLa中,编码三羧酸(Tricarboxylic Acid,TCA)循环中4个关键酶的基因(IDH1、IDH3A.ACO2和SUCLA2)的基因区包含多个高富集倍数的NF-κB结合峰,证明NF-κB结合这些基因。生物信息学分析表明,NF-κB结合峰中包含许多KB位点和显著类似于经典NF-κB结合模体(motif)的DNA基序。ChIP-qPCR检测表明,在TNFα刺激的HeLa和HepG2细胞中,NF-κB确实结合这些基因。双荧光素酶报告基因检测结果表明,NF-κB对这些基因的结合,具有转录激活此基因的功能。运用qPCR和Western blot检测,进一步证明在TNFα诱导的HeLa和HepG2细胞中,NF-κB可在mRNA和蛋白水平上刺激IDHl,IDH3A和AC02基因的表达。qPCR和Western blot检测也表明,NF-κB可在mRNA水平下调SUCLA2基因的表达,但未改变其蛋白丰度。因此,本章研究将IDHl.IDH3A.AC02和SUCLA2鉴定为TNFα诱导的NF-κB靶基因。这些研究结果从细胞的能量代谢角度解析了NF-κB在肿瘤演进过程中的分子功能。5. NF-KB调控神经母细胞瘤基因NBPF的表达研究发现NBPF家族基因在神经母细胞瘤和灵长类进化中发挥重要功能。但是该家族基因的表达调控机制至今仍未见报道。本章首先发现在TNFα刺激的HeLa细胞内,NBPF家族基因的基因区包含大量高富集倍数的NF-κB结合峰。而且这些结合峰中包含许多κB位点。此结果表明NF-κB结合NBPF家族基因。qPCR和Westem blot检测表明,在TNFα诱导的HeLa和HepG2细胞中,NF-κB调控NBPF家族基因的表达。因此,将NBPF家族基因认为为TNFα诱导的NF-κB靶基因。此外,生物信息学分析表明,NBPF蛋白序列上存在经典的核定位信号。Western blot检测表明,NBPF蛋白在HeLa、 HepG2及ECa109细胞的核蛋白中均有分布。免疫荧光检测也表明,NBPF分布于以上三种细胞的细胞核内。因此,NBPF为细胞核分布蛋白。进一步的Phyre2软件分析表明,NBPF家族蛋白N端具有类似经典转录因子STAT1/STAT3B的DNA结合结构域。基于这些研究结果,推测细胞核内的NBPF可能具有转录因子功能。总之,本章研究发现NBPF为TNFα诱导的NF-κB靶基因,其编码蛋白可能为DNA结合型转录因子。该发现为充分解读NF-κB通过NBPF在神经母细胞瘤进展中的分子功能奠定基础。总之,本论文通过联合运用高通量技术、生物信息学方法和传统生物学技术等研究技术,鉴定了14个TNFα诱导的NF-κB靶miRNA,如,miR125b-1和miR-1276.同时还鉴定出促凋亡基因CASP9、癌症相关基因CYCS.MITF.FZD1.FZD8 和PIAS1、TCA循环关键酶基因IDHl.IDH3A.ACO2和SUCLA2,以及NBPF家族基因为TNFα诱导的NF-κB靶基因。这些研究结果丰富了NF-κB的靶基因调控网络,进一步解读了NF-κB在肿瘤等重大疾病进展中的分子生物学功能及其作用机理,为NF-κB的生物医学应用提供了新的依据。