论文部分内容阅读
【目的】 1. 检测肿瘤关键转录抑制因子Pokemon及EMT（上皮间质转化）核心转录因子Snail、HPV感染标志物P16和Survivin在宫颈病变组织（宫颈炎、宫颈上皮内瘤变（CIN）、未转移宫颈癌、已转移宫颈癌）中的表达，并探讨其相关性。 2. 明确Pokemon在宫颈癌细胞中对Snail、P16、Survivin转录表达的影响。 3. 探讨siRNA沉默Pokemon基因后对宫颈癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及凋亡的影响。 4. 探讨Pokemon是否通过Snail来影响宫颈癌细胞的EMT和侵袭转移，及是否参与HPV致癌的过程。 【方法】 1. 免疫组化SP法检测Pokemon及Snail、P16、Survivin在宫颈病变组织（宫颈炎48例、CIN48例、未转移宫颈癌51例、已转移宫颈癌48例）中的表达并进行相关性分析。 2. qRT-PCR检测宫颈癌细胞Hela细胞(HPV18+)、C33A细胞(HPV-)中沉默Pokemon基因后Pokemon和Snail、P16、Survivin的mRNA表达。 3. 采用CCK-8，平板克隆，划痕实验及Transwell小室及流式细胞术等技术分别检测沉默Pokemon基因对宫颈癌Hela细胞(HPV18+)、C33A细胞(HPV-)增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力及凋亡的影响。 【结果】 1. 在宫颈病变组织中，Pokemon及Snail、P16、Survivin的表达情况及其相关性 (1) 以宫颈炎、CIN、未转移宫颈癌、已转移宫颈癌为序，Pokemon 蛋白的阳性表达率分别为4.17%(2/48)、25.00%(12/48)、64.58%(31/48)、68.19%(30/44)； Snail 蛋白的阳性表达率分别为 2.08%(1/48)、31.91%(15/47)、58.82%(30/51)、67.44%(29/43)；P16 蛋白的阳性表达率分别为 8.51%(4/47)、57.14%(24/42)、79.55%(35/44)、86.05%(37/43)；Survivin蛋白的阳性表达率分别为8.51%(4/47)、34.04%(16/47)、54.35%(25/46)、76.19%(32/42)；以上差异均具有显著性(P<0.05)。Pokemon 及 Snail、P16、Survivin 四种蛋白的染色强度与宫颈病变级别之间的Spearman相关系数依次是0.55、0.53、0.64、0.55。阳性率和染色强度两指标指示的趋势一致。 (2) Spearman等级相关分析显示：宫颈癌组中Pokemon蛋白与Snail蛋白、P16蛋白、Survivin蛋白的表达阳性率均呈正相关，相关系数分别为0.68、0.73、0.72，各P<0.01。 2. 在Hela和C33A细胞中，siRNA沉默Pokemon基因后，与NC对照组比，实验组Pokemon mRNA分别下调了75.8%和82.9%，其蛋白水平也相应下调；Snail、P16、Survivin mRNA分别下调了92.3%和42.0%、72.7%和50.5%、38.0%和59.1%，各P<0.05。两株细胞的结果相似。 3. 在Hela和C33A细胞组中，siRNA沉默Pokemon基因后，与NC对照组比，实验组增殖抑制率分别为10.89%(24h)、23.43%(48h)、23.45%(72h)、9.03%(96h)和4.53%(24h)、10.70%(48h)、20.97%(72h)、14.04%(96h)；克隆形成率分别下降27.99%和22.34%；划痕伤口迁移抑制率分别为50.00%和33.92%；侵袭抑制率分别为33.06%和36.92%；凋亡率分别升高26.46%和18.98%；各P<0.05。两株细胞的结果相似。 【结论】 1. 本文显示Pokemon和Snail的表达随宫颈肿瘤恶性程度升高而升高，并呈正相关；siRNA沉默Pokemon基因后，Snail mRNA表达下降，宫颈癌细胞的增殖率及迁移侵袭率也下降，表明Pokemon能促进宫颈癌EMT和侵袭转移，其分子机制可能是通过刺激Snail转录表达。 2. 本文显示Pokemon和P16、Survivin的表达随宫颈肿瘤恶性程度升高而升高，并呈正相关；siRNA沉默Pokemon基因后，P16和Survivin mRNA表达下降。既然P16和Survivin蛋白表达是HPV感染的标志，本结果提示Pokemon可能参与HPV致癌的过程。但是，在Hela (HPV18+)和C33A（HPV-）细胞中沉默Pokemon基因，P16和Survivin 的mRNA表达均下降，提示Pokemon与HPV致癌过程无关。这个矛盾有待进一步研究解决。 3.Pokemon被称为“肿瘤总开关”，是一个强有力的癌基因，但是到目前为止， Pokemon在宫颈癌中的作用及在宫颈癌EMT方面的研究少有报道。本文初步探讨了Pokemon在促进宫颈癌EMT及侵袭转移中的作用，为进一步研究其分子机制打下了基础。