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研究背景:肝细胞癌(（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是目前导致人类死亡的最主要癌症之一。由于缺乏有效的治疗,晚期患者的复发性和转移性肝癌往往预后极差。临床调查发现,胰岛素样生长因子2（IGF2）mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）在人类HCC中过表达,促进促癌基因的激活,与癌症进展和不良预后有关。因此,靶向IGF2BP1,抑制促癌基因的激活,能有效控制HCC的进程。黄连,味苦,性寒,具有清热燥湿、泻火解毒之作用。中医理论认为肿瘤由于邪气入侵并长期在体内淤积,出现毒聚所致。现代药理研究明确了黄连具有解热、镇痛、抑菌、抗炎、降糖和抗肿瘤等作用。前期通过细胞实验筛选黄连各主要生物碱的抗肝癌活性,发现黄连碱（coptisine,COP）可抑制肝癌细胞Hep G2和Hu H7的增殖和迁移,促进肝癌细胞凋亡,但是具体机制不明确,为了明确黄连抗肝癌活性成分及为新药研究提供理论依据,需要进行更深入的研究。研究目的:1.明确黄连中抗肝癌活性成分黄连碱在HCC发生、发展、转移中的作用。2.基于转录组学分析、细胞热位移（CETSA）和质谱联合分析等,挖掘黄连碱抑制肝细胞癌增殖和转移的关键直接作用靶点。3.通过在体内和体外过表达和沉默黄连碱直接作用的关键靶点IGF2BP1,阐明其在肝细胞癌中的作用。4.明确黄连碱对直接作用关键靶点IGF2BP1的作用方式,阐明IGF2BP1在黄连碱干预后的蛋白水平减少的分子机制。方法与结果:1、黄连碱对肝细胞癌的体内体外活性评价MTT、细胞克隆形成和EdU染色实验结果显示黄连碱对Hu H7、7404和Hep G2细胞增殖具有抑制效果,且黄连碱对Hu H7细胞的作用更为敏感,而对正常的人肝细胞LO2对黄连碱作用不敏感;流式细胞术结果显示黄连碱可诱导Hu H7、7404和Hep G2细胞发生周期阻滞以及细胞凋亡;划痕愈合和Transwell实验显示黄连碱抑制肝癌细胞的迁移和侵袭;以Hu H7裸鼠皮下移植瘤为模型,在裸鼠体内,黄连碱可以显著抑制Hu H7荷瘤裸鼠的肿瘤生长,各组裸鼠体重以及脏器指数均无显著差异,证明黄连碱对裸鼠无明显的毒副作用。2、IGF2BP1是黄连碱抗肝细胞癌的潜在靶点基于转录组学分析黄连碱对Hu H7细胞转录水平的改变,联合TCGA数据库中肝癌的差异基因求得交集基因共2052个,通过GO富集和KEGG分析结果显示黄连碱处理Hu H7细胞后,差异基因主要与细胞周期和增殖,以及细胞迁移侵袭相关;联合CETSA结合LC-MS/MS蛋白组学技术,经过质谱鉴定后得到205个蛋白质,并确认关键靶点IGF2BP1;分子对接黄连碱与IGF2BP1的结合能为3.40 kcal/mol,并发现黄连碱能与IGF2BP1的KH3/4结构域中538和487位点的赖氨酸以及489和520位点的谷氨酸发生作用;IGF2BP1的靶基因与转录组差异基因有7774个重叠基因,与TCGA肝癌相关数据库求交集得到1190个基因,通过GO富集和KEGG分析结果显示与细胞增殖和细胞周期以及细胞迁移相关;通过（http://ualcan.path.uab.edu）网站分析了IGF2BP1在肝细胞癌中的表达,结果显示IGF2BP1在正常组织中低表达,在肝癌组织中高表达,且随着肿瘤的分期逐渐变高,同时IGF2BP1的高表达与肝癌的生存预后显著相关;Western blot检测在细胞存活时给予黄连碱处理后,能显著降低IGF2BP1的表达。3、沉默和过表达IGF2BP1对肝细胞癌的影响通过在体外沉默和过表达IGF2BP1探讨IGF2BP1对肝癌细胞生长的影响。细胞克隆形成和EdU染色实验结果显示,沉默IGF2BP1对Hu H7和7404细胞的增殖具有抑制效果,过表达IGF2BP1对7404和Hep G2细胞的增殖具有促进效果;流式细胞术显示,沉默IGF2BP1可诱导Hu H7和7404细胞发生周期阻滞以及细胞凋亡,过表达IGF2BP1能缓解由黄连碱引起的周期阻滞以及细胞凋亡。划痕愈合和Transwell实验显示,沉默IGF2BP1抑制MHCC97-H和7404细胞的迁移和侵袭,过表达IGF2BP1能促进对7404和Hep G2细胞迁移和侵袭,并缓解由黄连碱引起的迁移和侵袭抑制;以Hu H7细胞为基础,构建稳定过表达和沉默IGF2BP1的细胞株,建立裸鼠皮下移植瘤模型,沉默IGF2BP1可以显著抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长,而过表达IGF2BP1可以显著促进荷瘤裸鼠的肿瘤生长。4、黄连碱通过泛素化促进IGF2BP1的降解使用Western blot检测在黄连碱干预后人肝癌Hu H7、7404和Hep G2细胞中IGF2BP1蛋白稳定性的改变,结果显示黄连碱处理后的IGF2BP1蛋白的半衰期显著缩短,蛋白稳定性显著下降;使用Western blot检测在黄连碱干预后人肝癌Hu H7细胞中IGF2BP1蛋白泛素化情况的变化,结果显示黄连碱直接作用后能使IGF2BP1的泛素化增加。通过Western blot检测在蛋白酶体抑制剂MG132干预后可以显著增加被黄连碱降低的IGF2BP1的蛋白水平。联合免疫沉淀和生物质谱鉴定与IGF2BP1作用的蛋白质,通过与IGF2BP1预测的去泛素化酶和E3连接酶数据集求交集,找到黄连碱作用后引起IGF2BP1降解的关键酶包括去泛素化酶泛素特异性蛋白酶10（USP10）或E3连接酶前mRNA加工因子19（PRPF19）。进一步通过对肝癌细胞系沉默PRPF19或过表达USP10可以挽救被黄连碱降低的IGF2BP1的蛋白水平,并且能减缓由黄连碱引起的IGF2BP1蛋白半衰期变短。结论:本研究表明,黄连碱在体外和体内均具有抑制人肝癌细胞生长的作用,进一步研究发现IGF2BP1是黄连碱抗肝癌的直接作用靶点。黄连碱通过促进IG2BP1与E3连接酶PRPF19的作用以及减少IGF2BP1与去泛素化酶USP10的作用,增加IGF2BP1的泛素化降解,减少IGF2BP1的表达从而发挥了抗肝癌的作用。为研究中药抗肿瘤的现代化药理和分子机制提供新的方向。