水稻LHR1同源基因功能的初步研究

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多胺(Polyamine)作为一种多聚阳离子,在基因表达、蛋白活性等多层面调节细胞功能。多胺转运蛋白(Polyamine transporters)能够特异性介导多胺类物质跨膜运输,在调节多胺浓度、调控抗性基因表达、维持mRNA水平、增强植物抗逆性等方面具有重要功能。目前,已知拟南芥(Arabidopsis thaliana)LHR1基因编码质膜多胺转运蛋白AtPUT3,控制多胺的吸收,参与植物热胁迫早期反应中的分子调控过程,但水稻中(Oryza sativa),多胺参与植物热胁迫早期反应的具体分子机制尚不明确。通过序列对比,发现水稻Os02g47210和Os03g37984是拟南芥AtPUT3的功能同源基因。为了初步阐明水稻多胺转运蛋白LHR1在热胁迫早期防御反应及提高植物耐热性上的功能,本研究利用生物信息学、生化与分子生物学实验、遗传学等手段对水稻LHR1同源基因的功能进行初步研究,结果如下:1.克隆了水稻OsLHR1(Os03g37984.1、2、3和Os02g47210)基因全长CDS,并对该基因编码的蛋白质进行有效的生物信息学分析,结果显示:Os03g37984有5种不同的剪切方式,编码5种OsPUT3蛋白。Os03g37984.1基因CDS全长为1653bp、Os03g37984.2基因CDS全长为1479bp、Os03g37984.3基因CDS全长为1428bp,Os03g37984.4和Os03g37984.5与Os03g37984.3基因序列重叠率很高。Os02g47210基因CDS全长为1695bp,编码OsPUT1蛋白。水稻OsLHR1(Os03g37984.1、2、3和Os02g47210)含有四种与跨膜及多胺转运相关的结构域:跨膜相关载体蛋白AApermease2,在APC超级家族中,AApermease2是多胺及氨基酸的特异性转运蛋白;氨基酸运载体PotE,转运和代谢氨基酸;2A0306,转运和结合蛋白质、氨基酸、多肽和胺类物质;精胺的反向运载体PRK10644,调控精胺运输。2.构建了荧光表达载体p35s::OsLHR1-GFP(p35s::OsOs03g37984.1、2、3-GFP及p35s::Os02g47210-GFP),通过根癌农杆菌GV3101介导法转化洋葱内表皮细胞,并通过荧光显微镜观察到OsLHR1基因定位在洋葱内表皮细胞的细胞膜上。3.构建了过表达载体p35s::OsLHR1(p35s::Os03g37984.1、2、3及p35s::Os02g47210),利用根癌农杆菌介导法转化拟南芥突变体lhr1,通过载体植物抗性筛选,获得转基因苗。4.拟南芥突变体lhr1的功能互补。通过将水稻OsLHR1基因克隆后转入拟南芥突变体lhr1中,筛选纯合子,在1μM百草枯抗性培养基中,转基因植株恢复了对百草枯敏感的表型。
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