研究背景胰腺癌是最难早期发现、恶性程度最高和预后最差的肿瘤之一。美国癌症协会的统计结果表明,胰腺癌占美国全部肿瘤死亡原因的第四位,5年生存率在5%以下。其死亡的主要原因是超过50%患者在发现时已处于晚期,肿瘤已包绕血管或发生远处转移,且对传统的放化疗或靶向治疗具有一定耐受性。因此,提高胰腺癌的早期诊断率,抑制肿瘤的生长和远处转移,提高药物的治疗效果,成为改善胰腺癌癌患者预后的关键因素。近年来的研究发现,CHIP蛋白作为一种分子伴侣和泛素连接酶,在细胞内蛋白质的调控方面发挥重要的作用。CHIP蛋白的碳末端可以和热休克蛋白70/90(Hsp70/90)结合,在泛素结合酶的帮助下使热休克蛋白的底物结合上泛素,并呈递给蛋白酶体系统降解。CHIP蛋白可以对机体内信号传导通路中的关键蛋白和异常折叠蛋白的表达进行精确的调控,该蛋白的异常表达是导致肿瘤发生发展和神经退行性病变的重要因素之一。目前,CHIP蛋白对胰腺癌的调控功能和机制研究尚不清楚,我们希望通过对该蛋白的研究,为早期发现胰腺癌,深入了解胰腺癌形成、发展、转移和耐药机制提供一个新的思路。研究目的1)探索CHIP蛋白对胰腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭和转移能力的影响;2)寻找CHIP蛋白的靶蛋白,了解其在肿瘤相关信号通路中发挥的作用;3)小鼠体内进一步验证CHIP蛋白对胰腺癌细胞的影响;4)评估CHIP蛋白在胰腺癌鉴别诊断和胰腺癌患者预后的价值。研究方法1)通过慢病毒载体将CHIP的microRNA(作为RNAi)或CHIP基因插入胰腺癌细胞株Panc-1、Bxpc-3、SW1990中,建立稳定沉默或稳定过表达CHIP的胰腺癌细胞株。2)通过CCK-8法观察CHIP沉默或过表达对肿瘤细胞增殖水平的影响;通过流式细胞术检测CHIP沉默或过表达对靶向药物厄洛替尼诱导细胞凋亡的影响;通过Transwell小室检测CHIP沉默或过表达对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响。3)通过免疫共沉淀技术寻找CHIP的靶蛋白,通过时间依赖梯度观察CHIP对靶蛋白表达水平的影响;通过蛋白电泳和Western blot检测CHIP蛋白对肿瘤相关信号通路中关键蛋白表达水平的影响。4)通过建立小鼠皮下移植瘤模型观察CHIP蛋白沉默或过表达对小鼠成瘤的影响,观察CHIIP蛋白沉默或过表达对厄洛替尼诱导肿瘤组织凋亡的影响;通过胰腺癌细胞脾脏注射肝转移模型观察CHIP蛋白沉默或过表达对肿瘤细胞转移能力的影响;通过免疫组化观察肿瘤组织中CHIP蛋白和靶蛋白表达水平的差异。5)通过免疫组化研究明确CHIP蛋白在胰腺癌患者组织中的表达水平及其对患者预后的影响,通过ELISA法检测人CHIP蛋白在肿瘤患者血清中的表达水平,评估其作为鉴别诊断及判断预后的价值。研究结果1)成功构建稳定沉默或过表达CHIP蛋白的胰腺癌细胞株Panc-1、Bxpc-3及SW1990。2)CHIIP蛋白沉默以后,胰腺癌细胞株的增殖能力较对照组明显增强,厄洛替尼诱导细胞凋亡能力明显减弱,细胞株侵袭和转移能力明显增强;CHIP蛋白过表达以后,胰腺癌细胞株的增殖能力较对照组明显减弱,厄洛替尼诱导细胞凋亡能力明显增强,细胞株侵袭和转移能力则明显减弱,以上组间差异比较均有统计学意义(P<0.05)。3)通过免疫共沉淀发现在胰腺癌细胞株Bxpc-3中,内源性CHIP蛋白可以和内源性表皮生长因子受体(EGFR)蛋白结合,外源性CHIP蛋白可以和外源性EGFR结合;CHIP蛋白可以诱导EGFR蛋白降解,并呈时间依赖性。CHIP蛋白与EGFR结合依赖于CHIP蛋白的TPR和U-Box区的同时存在；CHIP蛋白对EGFR的调控需要EGFR酪氨酸845位点的磷酸化。免疫荧光检测发现,CHIP蛋白的表达可以明显抑制细胞胞膜EGFR的表达水平,当EGF介导EGFR进入胞浆和胞核的时候CHIP还可以促进其降解。在胰腺癌细胞中,CHIP可以通过降解EGFR抑制下游PI3K/AKT/mTOR通路的激活,还可以通过降解EGFR抑制下游Src/FAK通路的激活。4)对胰腺癌小鼠皮下移植瘤模型研究发现,CHIP稳定沉默细胞株的肿瘤生长速度要明显高于对照组(p<0.01),CHIP稳定过表达细胞株肿瘤生长速度低于对照组(p<0.01);厄洛替尼干预条件下,CHIP稳定沉默组细胞株肿瘤生长速度高于对照组(p=0.034),而CHIP过表达细胞株生长速度低于对照组(p<0.01)。免疫组化研究发现,CHIP稳定沉默组织细胞CHIP表达水平明显降低,EGFR表达水平明显升高,两者呈负相关(p=0.045),Ki67表达水平明显升高(p=0.021);CHIP稳定过表达组织细胞CHIP表达水平明显升高,EGFR表达水平明显下降,两者呈负相关(p<0.01),Ki67表达水平明显下降(p=0.026)。对肿瘤细胞脾脏注射肝转移模型的研究发现,CHIP稳定沉默细胞肝转移灶数目较对照组明显增多(p<0.01),CHIP稳定过表达细胞肝转移灶数目较对照组明显减少(p<0.01)。5)通过对人胰腺癌组织标本的免疫组化研究发现,CHIP在癌组织的表达与癌旁组织比较并无差异。胰腺癌中CHIP的表达水平与淋巴结转移呈负相关(p=0.041),其表达水平也和术后肿瘤转移负相关(p=0.01),CHIP低表达可能是胰腺癌患者预后不良的危险因素(单因素分析P=0.039,多因素分析无差异)。ELISA方法检测人血清中CHIP蛋白表达水平发现,慢性胰腺炎、胰腺良性肿瘤、胰腺内分泌肿瘤和胰腺导管腺癌患者的血清CHIP蛋白表达水平要显著低于正常人血清CHIP表达水平(p<0.01),胰腺良性肿瘤、胰腺内分泌肿瘤和胰腺导管腺癌患者CHIP表达水平要显著低于慢性胰腺炎患者(p<0.05)。CHIP蛋白用于鉴别正常人和慢性胰腺炎患者的敏感性94.4%,特异性74.5%;用于鉴别正常人和胰腺导管腺癌患者的敏感性93.6%,特异性85.1%;用于鉴别慢性胰腺炎和胰腺导管腺癌的敏感性68.09%,特异性77.78%。胰腺癌患者血清中CHIP表达高低与肿瘤是否发生远处转移呈负相关(p=0.01)。研究结论1)CHIP蛋白可以抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力,并能够促进厄洛替尼诱导的细胞凋亡;2)CHIP蛋白对胰腺癌细胞的影响主要是通过泛素化降解EGFR实现,EGFR的第845位点酷氨酸残基磷酸化是其泛素化降解的因素之一,CHIP蛋白可以通过抑制EGFR表达从而抑制其下游PI3K/AKT/mTOR通路和Src/FAK通路的激活,从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭转移能力;3)CHIP蛋白可以在小鼠体内抑制肿瘤的生长和转移能力,还可以促进厄洛替尼诱导的肿瘤组织细胞的凋亡;4)CHIP在胰腺癌组织相对癌旁组织表达无明显差异,其表达水平与淋巴结转移呈负相关,CHIP低表达可能是预后不良的危险因素。CHIP在胰腺癌患者血中表达水平明显降低,可作为鉴别正常人、慢性胰腺炎、胰腺癌患者的血清学标志物,其血清中表达水平与肿瘤远处转移呈负相关。