[研究背景]Hedgehog-Smoothened(Hh-SMO)信号通路是一条高度保守并且在胚胎发育时期起关键作用的信号通路。在正常人体内,组织Hh配体表达关闭,PTCH与SMO结合抑制SMO的活性,导致该通路通常处于关闭状态。多项研究表明,Hh-SMO信号通路在多种肿瘤中重新激活,如皮肤基底细胞癌、髓母细胞瘤、肺癌、消化道肿瘤、乳腺癌、胰腺癌等。因此,阻断肿瘤细胞中的Hh-SMO信号通路将是人类治疗肿瘤的一个新的有效手段。针对Hh-SMO通路的抗肿瘤药物的研发是目前国际上的一个研究热点。其中SMO抑制剂的研发走在最前沿,SMO抑制剂GDC-0449已被美国FDA批准上市用于治疗基底细胞癌,GDC-0449治疗其他实体瘤的研究正处于临床Ⅰ/Ⅱ期。此外,数个近期报道的由跨国药业研发的SMO抑制剂的抗肿瘤研究也纷纷进入临床Ⅰ/Ⅱ期。然而,目前我国还没有具有自主产权的SMO靶向抑制剂进入临床研究阶段。因此,本课题旨在建立并鉴定一系列SMO抑制剂的体外和体内筛选体系,并对一系列针对SMO靶点设计的化合物进行筛选。期望得到具有中国自主产权的新型SMO抑制剂。[方法]1)我们建立了Gli-Luciferase报告基因筛选平台并对化合物进行了初步筛选。2)对初步筛选出的化合物进行了进一步的体外药理学研究,建立了相关筛选平台并进一步确定活性化合物对Hh-SMO信号通路在基因、蛋白和细胞水平的作用。3)采用流式细胞术初步探索了活性化合物抑制细胞生长的机理。4)运用western blot检测了活性化合物对AKT/mTOR信号通路的影响。5)通过GIPZ-shRNA慢病毒技术平台建立了SMO沉默稳转细胞株,研究SMO沉默对Hh-SMO信号通路的影响以及SMO沉默对细胞生长的影响,用于对比SMO沉默与SMO抑制剂的药理共性。6)我们建立了Calu-6人肺癌移植瘤模型,用于初步确定活性化合物对体内Hh-SMO信号通路的抑制作用以及体内血药浓度。7)同时,我们建立了Ptch+/-P53-/-基因敲除小鼠髓母脑瘤模型和皮下瘤模型,用于确定活性化合物的体内抗肿瘤药效。[结果]1)成功建立了Gli-Luciferase报告基因筛选平台并初步筛选出了8个相对有效的活性合物。2)通过Hh-SMO通路相关基因、蛋白和细胞水平的体外药理筛选研究,获得了数个SMO抑制剂活性化合物,如HH-1、HH-13、HH-20等。这些全新化合物在nM浓度能显著抑制Hh-SMO通路Gli-1、PTCH、CyclinD1等关键标识物mRNA和蛋白水平的表达。3)1 μM的HH-13和HH-20能拮抗SHH诱导的细胞周期,导致G0/G1期阻滞,降低细胞增殖和存活。4)HH-13和HH-20能显著降低SHH诱导的S6和AKT蛋白的磷酸化,提示抑制mTORC1和mTORC2通路激活。5)通过GIPZ-shRNA技术、western blot和RT-PCR确定了SMO沉默T24膀胱癌稳转株的成功构建,SMO沉默能够抑制Gli-1和CyclinD1蛋白的表达并抑制T24细胞的生长。6)成功建立了Calu-6人肺癌移植瘤模型,经口服给药确认HH-1、HH-13和HH-20能够抑制Calu-6肿瘤基质组织细胞中的Hh-SMO信号通路,并检测了体内血药浓度；HH-1和HH-13具有较高的口服后血液暴露量。7)成功建立了Ptch+/-P53-/-基因敲除小鼠髓母脑瘤模型及其皮下移植瘤模型。HH-1、HH-13和HH-20能够显著的抑制Ptch+/-P53-/-基因敲除髓母细胞皮下瘤的生长。[结论]本课题成功建立并验证了一系列SMO抑制剂开发的体外和体内筛选平台。通过化合物设计、体外和体内研究获得了数个有自主产权的、有重要价值的SMO抑制剂活性化合物。化合物HH-1、HH-13和HH-20等针对Hh-SMO通路的基因表达和蛋白合成均有显著抑制活性。在体内药理实验中,HH-1和HH-13具有良好的口服生物利用度,能有效抑制Calu-6人肺癌移植瘤基质组织细胞的Hh-SMO信号通路,并抑制Ptch+/-P53-/-基因敲除髓母细胞皮下移植瘤的生长。本研究所得到的先导化合物为SMO抑制剂的进一步研发打下了良好的基础。[研究背景]越来越多的证据表明,细胞代谢与肿瘤发生有很大的关系。恶性肿瘤细胞中通常会有代谢的改变,如脂合成和糖酵解速率的增加。代谢失调在肿瘤的发生和发展中有重要作用。ATP citrate lyase (ACL)是连接葡萄糖代谢和脂代谢的关键酶。大量研究报道在一些永生细胞和肿瘤,包括膀胱癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、脑癌和前列腺癌中,ACL的表达和酶活性显著升高。ACL是肿瘤治疗的潜在靶点。肺癌是全世界肿瘤死亡率最高的恶性肿瘤之一,且肺癌中糖酵解和脂肪酸合成速率很高。在病人的肺癌组织中,ACL表达量升高,活性增强。所以,研究ACL在肺癌中的发病机理和ACL的潜在治疗效果将为肺癌治疗提供新的有效治疗手段。[方法]1)ACL沉默的H1975稳转株的建立：选用TRIPZ-ACL shRNA慢病毒体系建立ACL沉默稳转肿瘤细胞株。慢病毒质粒转染HEK-293T细胞进行病毒包装、收取。用ACL病毒感染H1975细胞,puromycin筛选,doxcycline (Dox)诱导,western blot和RT-PCR检测ACL沉默效果。2)确定ACL沉默对肿瘤细胞生长的影响：TRIPZ-ACL病毒感染目标细胞,加puromycin筛选,Dox诱导ACL沉默,用细胞计数、克隆形成实验和SRB染色技术观察肿瘤细胞的生长是否受抑制；同时提取细胞蛋白检测细胞生长相关蛋白。阐明ACL在肿瘤生长中的作用。[结果]1)建立了ACL沉默H1975稳转细胞株：选用ACL shRNA-1和ACLshRNA-3进行病毒包装并感染H1975细胞。Western blot和RT-PCR表明ACLshRNA-1和ACL shRNA-3在H1975细胞中有很好的沉默效果。2)细胞计数、克隆形成实验和SRB染色实验均表明ACL沉默后能够显著抑制肿瘤细胞的生长。Western blot结果也表明ACL沉默后p-AKT (S473)的水平明显降低,提示AKT信号通路转导水平下调。[结论]采用TRIPZ慢病毒体系成功建立了ACL沉默肺癌H1975稳转细胞株。研究表明ACL沉默能够显著抑制肿瘤细胞的生长,其分子机制可能与下调AKT信号通路有关。