研究背景：　　量子点(QDs)是近些年发展起来的一种新型纳米材料，直径在2～20nm，它具备一些传统染料不可比拟的光电学优势，使其可以成为一类理想的生物荧光探针。比如QDs激发波长宽、发射波长窄，这样使得可以用同一种波长的激发光同时激发多种不同量子点而发射出不同颜色的荧光；QDs的发射峰窄且对称，重叠小，因此在检测时不会出现互相干扰的问题；QDs具有尺寸效应，即通过调节QDs的大小和组成，可以产生不同发射波长的荧光，据此特性可以根据研究需要合成任意粒径的QDs；最后，QDs的荧光强度和稳定性都很好，是普通荧光染料的100倍左右，几乎没有褪色现象。QDs在经过各种化学修饰之后，生物相容性也非常好，并且对生物体危害小。因此将QDs用于生物荧光标记，在很多领域如医学诊断、基因和蛋白质的高通量分析，特别是在流式细胞术免疫分析、快速诊断增敏等方面都具有广阔的应用前景。　　研究目的：　　构建基于QDs标记实验诊断与分析技术平台，包括用于抗核抗体(ANA)检测的间接免疫荧光法(IIFA)与环瓜氨酸肽抗原特异性T细胞(CCP/AST)的流式细胞术(FCM)。对其在ANA临床样本检测、细胞成像中的效果进行评价，同时研究CCP/AST细胞在胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)小鼠疾病发生发展中的作用。　　研究方法：　　用2种粒径不同的QDs制备QDs标记二抗[QDs-GAHIgG-F(ab’)2]或QDs标记链酶亲合素(QDs-SA)，分别用单色及多色QDs同时标记，采用间接免疫荧光法(IIFA)对临床样本ANA滴度进行检测和表征成像，并与FITC标记二抗检测结果进行比对。具体包括两种ANA测定模式：(1)QDs标记IIFA两步法：用QDs直接标记二抗对温育标本直接进行荧光染色；(2)QDs标记IIFA-三步法：先行采用生物素化第二抗体与温育标本结合，再用量子点标记QDs-SA进行荧光染色。同时，建立CIA小鼠模型，以QDs-SA结合生物素化CCP抗原肽，采用FCM检测CCP/AST细胞在CIA小鼠中阳性率，研究其与特异性T细胞增殖结果及与炎症发生的关系。　　研究结果：　　1.经对114例自身免疫病患者血清研究发现，两种QDs标记二抗均可见与FITC标记二抗检测ANA结果相同或类似的荧光模式，但ANA滴度略显不同，对核颗粒型与胞浆颗粒型ANA测定灵敏度以QD655为最高，QD605次之，FITC标记二抗相对较弱。而对核均质型、核仁型与核着丝点型ANA测定灵敏度高低依次为FITC、QD655和QD605标记二抗。相关分析结果显示，两种QDs与FITC标记物检测ANA结果均呈高度正相关，r值分别为0.834、0.832(P均<0.01)。两种QDs标记二抗对核颗粒型、胞浆颗粒型荧光模式与FITC标记二抗检测结果阳性符合率均为100％；而核均质与核仁型检测结果，阳性结果符合率为80.6％～84.4％；30例用FITC标记二抗检测ANA阴性血清中，两种QDs标记二抗检测均见有1例ANA阳性。两种QDs与FITC标记物检测ANA总符合率均超过90.0％，有高度的一致性(Kappa值均>0.75)。　　2.采用量子点标记链酶亲合素(QD655-SA、QD605-SA、QD565-SA、QD525-SA)与生物素化二抗(Bio-GAHIgG)结合，对临床样本ANA进行检测和细胞成像(IIFA三步法)，可获得较FITC和QDs标记二抗检测(IIFA两步法)更为敏感和准确的实验结果。除检出有细胞核颗粒与细胞浆颗粒型ANA外，对细胞核仁型、核均质型与核着丝点型ANA荧光模式亦能敏感检出。对临床样本和健康人对照组血清研究发现，QD655-SA、QD605-SA、QD565-SA与FITC标记检测阳性结果符合率均为100％，阴性结果符合率均为96.7％，具有高度的结果一致性(Kappa值均>0.75)。与FITC标记检测ANA结果滴度呈高度正相关，r值分别为0.900、0.882和0.938(P值均<0.01)。但QD525-SA检测ANA应用效果不佳。两种QDs联合应用于ANA检测，有助于区分和展示不同细胞周期核内靶抗原分布及可结合抗原-抗体复合物量的差异(因掺入荧光比例不同使得整个细胞核着染区分别呈红色、亮黄色、黄绿色和墨绿色不等)，并可有效实施ANA检测并对其水平做出合理评估。　　3.本实验在构建CIA小鼠模型的基础上，采用QD705-SA结合Bio-CCP抗原肽对CCP特异性T细胞进行体外标记和FCM检测，结果以CD4+CD8-CCP/TCR+为CCP/AST细胞阳性。研究结果发现，CIA模型组小鼠CCP/AST细胞阳性率(％)显著高于对照组小鼠，分别为0.903±0.960和0.093±0.091，亦显著高于模型组无关对照肽(PD2B)/AST细胞阳性率(0.149±0.099)，两者间差异均具有统计学意义(P<0.01)。相关分析结果显示，CCP/AST细胞阳性率与CIA小鼠关节炎症指数及用CCP抗原肽、抗CCP抗体、CCP/抗CCP抗体复合物刺激下淋巴细胞增殖结果均呈显著的正相关关系r值分别为0.591、0.728、0.739和0.581(P<0.01或P<0.05)。提示CCP/AST细胞的存在与关节肿胀和炎症程度关系密切。　　结论：　　基于QDs标记的IIFA检测ANA总体结果稳定、敏感、可信，QDs粒径越大对ANA测定的敏感度越高。采用QDs标记链酶亲合素-生物素系统对ANA进行IIFA检测可获得较FITC与QDs标记二抗更为敏感和准确的实验结果。表征结果显示多色量子点标记可区分和展示细胞核内靶抗原定位分布及可结合抗原-抗体复合物量的差异，并能有效实施对各种荧光核型的ANA检测和细胞成像。QDs标记链酶亲合素结合生物素化CCP抗原肽，可实现对CCP/AST细胞的标记和FCM检测，并发现其与CIA模型鼠关节肿胀和炎症发生程度关系密切。