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目的:非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatis, NASH)是以肝实质细胞脂肪沉积和肝小叶内炎症为特征的慢性肝脏疾病,与肥胖、高血糖症、高脂血症、高血压等胰岛素抵抗相关性疾病并存。抵抗素(resistin)是一种脂肪细胞因子,高水平抵抗素可诱导NASH的发生,其机制可能与抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)磷酸化、促进炎症因子的活化有关。研究非酒精性脂肪性肝炎发展的不同阶段大鼠肝组织抵抗素与AMPK的表达情况及血清抵抗素的表达水平及其与肝组织病理变化(脂肪变性、炎症、纤维化)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNFα)水平等的关系,揭示抵抗素在NASH发病机制中的作用及地位,为NASH的预防及治疗提供新的靶点。方法:选用雄性Wistar大鼠40只随机分为正常对照组(10只)和模型组(30只)。正常对照组给予标准饲料喂养,模型组予以高脂饮食喂养(标准饲料加2%胆固醇、10%猪油和5%玉米油)。分别于8、12、16周经股动脉放血处死,组织学染色证明NASH造模成功。留取血清,做血清生化指标、TNFα和抵抗素水平监测。留取肝右叶组织分为四部分,一部分用于快速冰冻切片,行SudanⅣ染色;一部分用10%的甲醛固定以做HE(haematoxylin-eosin, HE)染色及Masson染色;一部分用4%多聚甲醛固定用于抵抗素免疫组化染色;其余肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱, Western blot方法测定肝组织AMPKα的活性。用日本Olympus AU2700全自动生化分析仪检测血清胆固醇(cholesterol,TC),甘油三酯(triglyceride,TG),丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT),天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase , AST ) ;用酶联免疫吸附测定( enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清TNFα和抵抗素水平。HE染色观察肝组织普通病理变化;Masson染色观察肝组织纤维化的程度;SudanⅣ染色,观察肝细胞脂变程度;采用Power VisionTM二步法对肝组织进行抵抗素免疫组化染色。用多功能病理图象分析仪测定抵抗素表达面积百分比,每张片子取中央和四周五个区域,20倍物镜下计算平均面密度(阳性面积与统计场面积百分比)。采用Western blot方法测定肝组织AMPKα以及磷酸化AMPKα(P-AMPKα)蛋白的表达水平,以P-AMPKα/AMPKα比值代表AMPKα的活性。应用SPSS 13.0统计软件分析实验数据。结果:1大鼠的一般情况:随着造模时间的延长,正常对照组大鼠食欲佳,皮毛光滑,精神状态好,体重逐渐增加。模型组大鼠自造模开始至12周食欲亦佳,皮毛亦光滑,体重增加明显快于正常对照组,但在造模12周后逐渐精神萎靡,食欲减退,皮毛欠光滑,体重停滞不增。2各组大鼠生化指标及血清抵抗素、TNFα水平变化:8、12、16周模型组大鼠血清TC、TG、ALT、AST、TNFα水平以及抵抗素浓度均高于正常对照组(P<0.01, P<0.05),且随着造模时间的延长逐渐升高(P<0.01)。3肝组织病理学变化:肉眼下,正常对照组大鼠肝脏呈红褐色,明亮有光泽。模型组大鼠肝脏逐渐肿大,边缘渐圆钝,逐渐呈浅黄色或土黄色,切面油腻感增强。光镜下HE染色可见正常对照组大鼠肝小叶结构完整,肝细胞大小一致,呈多边形围绕中央静脉放射状分布。造模8周大鼠肝组织显示为单纯性肝脂肪变性,造模12周大鼠肝组织出现炎症细胞的浸润和造型坏死,造模16周大鼠肝组织炎症坏死程度加重。Masson染色显示正常对照组、8周和12周模型组大鼠中央静脉及汇管区未见明显胶原纤维,16周模型组大鼠存在窦周及中央静脉纤维化。SudanⅣ染色显示正常对照组大鼠肝细胞胞浆内无红染颗粒,随造模时间的延长,肝细胞胞浆中逐渐出现红色颗粒,且越来越密集。4肝组织抵抗素表达:肝组织免疫组化染色显示正常大鼠肝组织几乎不表达抵抗素,造模8周大鼠肝组织中央静脉周围可见少量抵抗素表达,随着造模时间的延长,肝组织抵抗素的表达明显增加,以中央静脉周围最为显著,汇管区周围亦有少量表达,定量分析显示四组间差异有统计学意义(P<0.01)。5肝组织AMPKα的活性:Western blot测定肝细胞胞浆内AMPKα和P-AMPKα蛋白表达水平,以P-AMPKα/AMPKα比值表示大鼠肝组织AMPKα的活性,结果显示大鼠肝组织AMPKα活性随造模时间的延长逐渐降低(P<0.01或P<0.05),且模型组均低于正常对照组(P<0.01或P<0.05),提示在NASH的进展过程存在AMPKα活性的降低。结论:1应用高脂饮食饲养大鼠可以成功复制NASH模型,其与NASH的发生发展关系密切。2抵抗素在大鼠肝组织中的表达随NASH的进展程度逐渐增多,主要集中于中央静脉周围。3血清抵抗素浓度和肝组织抵抗素的表达量随着造模时间的延长逐渐升高,且与TNFα水平呈正相关,表明抵抗素参与肝脏炎症的发生,在NASH的发生发展中起重要作用。4大鼠肝组织AMPKα的活性随造模时间的延长逐渐降低,与肝组织抵抗素表达量呈负相关,提示抵抗素参与NASH的形成可能与降低AMPK的活性有关。