凡纳滨对虾在不同盐度下的细胞、生理生化与分子响应

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作为一种广盐性的甲壳动物,凡纳滨对虾可以适应0.5~40‰的盐度范围,在盐度15~20‰条件下生长较快。研究显示低盐水平下对虾类的生长、蜕皮、氧消耗、血蓝蛋白含量、酶活力、物质代谢、氮排泄、渗透压、免疫功能和抗病力等均有不同程度的影响,一些研究显示其营养需求也发生改变。为探讨凡纳滨对虾适应高低盐度的生理、细胞和分子调控机理,本研究将凡纳滨对虾分别饲养于高盐度(20‰)和低盐度(5‰)两个盐度下,待其适应环境盐度两周后进行取样,应用流式细胞术(FCM)分析凡纳滨对虾血细胞对盐度的细胞响应;测定血清和肝胰腺免疫和抗氧化相关酶活性的差异;应用RNA-Seq技术对构建在不同盐度下血细胞和肝胰腺的数字基因表达谱文库,筛选差异表达基因,通过注释分析这些基因的功能;应用荧光定量PCR方法分析免疫和抗氧化相关基因表达量变化。联合上述结果,探讨了凡纳滨对虾针对不同环境盐度而作出的生理、细胞和分子调控机制。具体研究结果如下:  (1)研究不同盐度下的细胞响应。结果显示,低盐度(5‰)下,虾体中的血细胞总数(THC)、非特异性酯酶活性低于高盐度水平;活性氧(ROS)和NO含量均高于高盐度组;胞内游离Ca2+浓度在低盐度时较高;两组的血细胞凋亡率没有显著差异。结果表明在盐度低于等渗浓度时,血淋巴长期处于高渗状态,血细胞遭受一定的渗透压胁迫作用,诱导其产生ROS,对血细胞造成一定的氧化损伤,可能由于凋亡是一个快速的生理过程,因此在血细胞凋亡率上没有体现出差异,但THC在低盐度时显著下降,也可推测低盐度下,血细胞遭受氧化胁迫而加速血细胞的凋亡损耗;作为重要信号因子的NO在低盐度下体现出较高的含量,可能是由于NO在胞内各种调节过程中发挥信号因子作用;胞内游离Ca2+浓度在低盐度下较低,可能起到了维持血细胞内外渗透压平衡的作用;低盐度下酯酶活性以及THC的下降表明低盐度下对虾的免疫力受到了一定的抑制作用。这些结果展示了血细胞在不同盐度下做出了一定的调节过程,以适应该盐度的生存条件。  (2)研究不同盐度下对虾血清和肝胰腺酶活力的差异。结果显示,低盐度下,对虾血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力、总抗氧化能力(T-AOC)显著低于高盐度组,丙二醛(MDA)含量高于高盐度组;低盐度下,对虾肝胰腺GPx、SOD活力以及T-AOC均显著低于高盐度组,丙二醛(MDA)含量高于高盐度组,表明在低盐度下,对虾血清和肝胰腺的抗氧化活力均较低,导致脂质过氧化程度较高;低盐度下,对虾血清和肝胰腺中的酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活力均显著低于高盐度组,表明低盐度下对虾免疫力下降;低盐度下,对虾肝胰腺谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力下降,而血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力升高,表明低盐度下,对虾肝胰腺有一定损伤,这一结果与抗氧化活力的结果相一致。  (3)建立了高低盐度下凡纳滨对虾血细胞的数字基因表达谱分析。以错误发现率(False DiscoveryRate,FDR)≤0.001和|log2PRKM(5‰)/PRKM(20‰)|≥1为筛选条件,筛选出1423条差异表达的基因,其中420条上调,1003条下调。对这些差异表达基因进行GO和KEGG综合分析发现,环境盐度的差异主要显著影响了血细胞中外源性物质降解和代谢、DNA修复、抗胁迫、免疫防御以及调控因子等相关基因的表达水平。以高盐度为对照,低盐度时,血细胞调动了外源性物质的降解和解毒、抗胁迫抗氧化因子进行抗胁迫防御;可发现较多的DNA修复相关基因表达受到抑制,同时凋亡相关基因的表达被诱导,呈现了血细胞发生凋亡的分子过程;另外发现大量的肠道黏蛋白表达量上调,可能用于替代其它受到渗透压抑制的免疫因子进行免疫防御。  (4)建立了高低盐度下凡纳滨对虾肝胰腺的数字基因表达谱分析。筛选出4490条差异表达的基因,其中3262条上调,1228条下调。对这些差异表达基因进行GO和KEGG综合分析发现,环境盐度的差异主要显著影响了肝胰腺中外源性物质降解和代谢、生理代谢、抗胁迫、免疫防御的表达水平。以高盐度为对照,低盐度时,差异基因中有大量与生理代谢相关的基因,虾体作出生理代谢过程的改变,以适宜低盐环境并降低低盐胁迫带来的毒害作用;较多的与解毒相关基因表达量下调,可能在低盐度水平下,肝胰腺的解毒作用受到了抑制,此时机体将更多的能量用于物质代谢和调节渗透压,暗示在低盐度下,对虾的较容易遭受外源物质的毒性毒害作用。  (5)免疫和抗氧化相关基因表达量变化。结果显示,低盐度下,血细胞和肝胰腺中与解毒相关的细胞色素P450的表达量下降,与表达谱的结果一致,表明解毒作用受到了低盐环境的抑制;低盐度下,血细胞和肝胰腺的抗氧化酶SOD表达量下调,CAT表达水平没有显著,该结果与酶活性结果一致,表明低盐度下抗氧化活力也受到了一定的抑制;参与凋亡的caspase-3及QM2质量管理基因的表达量在血细胞和肝胰腺中呈现显著上升和下调,与先前的结果吻合,表明血细胞和肝胰腺均受到一定程度的损伤而发生凋亡;低盐度下,血细胞和肝胰腺的ACP和AKP表达水平均被下调,与酶活性结果一致,表明低盐度下对虾的免疫力下降。  综合上述研究结果,本研究初步构建了高低盐度下凡纳滨对虾的细胞、生理生化和分子响应的调控网络。研究成果进一步扩展了甲壳动物的基因库,为探索新基因的序列和功能提供了大量有效的信息,为深入研究凡纳滨对虾对盐度适应性调节机制以及对虾抗胁迫防御机理奠定基础,为不同盐度下的对虾养殖实践提供一定的理论指导。
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