研究背景全球每年约有1500万早产儿出生,随着医疗技术的发展,早产儿尤其是极低、超低出生体重儿的存活率显著增加,然而早产儿脑损伤和远期不良神经预后如脑瘫、智力低下、严重视听障碍等的发病率也明显增加,严重影响早产儿的生存质量。早产儿脑损伤没有特效的治疗方法,早期诊断和早期干预显得尤为重要。早产儿不良神经预后的防治是目前新生儿医学研究的重点。振幅整合脑电图(a EEG)是一项近年来发展起来的新生儿脑电监护技术,具有操作简单、受环境干扰少、判读容易、可持续床旁动态监测等特点。已证实生后早期的a EEG异常与足月新生儿缺氧缺血性脑病的临床分度及神经发育预后的相关性均强。但是,a EEG结果是否能够早期预测早产儿脑损伤及远期不良神经预后,目前尚不明确,且相关研究的样本量有限。促红细胞生成素(EPO)是一种在缺氧诱导下由肾脏产生的内源性糖蛋白,EPO除了刺激红细胞生成的作用外,在动物试验中还被证实具有神经保护作用。已证实重组人促红细胞生成素(rh EPO)治疗足月儿轻度至中度缺氧缺血性脑病安全有效。虽然近年来的研究证实rh EPO对早产儿也有神经保护作用,但应用的时机、剂量、疗程等均不明确,且远期随访资料有限,安全性尚不明确。已证实EPO能通过动物和人的血脑屏障进入脑组织,但不同报道中神经保护的有效浓度范围相差很大,rh EPO在早产儿血液及脑脊液中的药代动力学报道尚少。代谢组学(Metabolomics)是上世纪末兴起的一门高通量地定量考察生物体系中小分子代谢物含量及其通路行为的学科,与基因组学、转录组学以及蛋白质组学等一样,是系统生物学的一个分支。在医学领域,代谢组学主要应用在两个方面:1.研究药物作用或疾病本身的机理;2.寻找可以用于诊断、预后以及药效监测的分子标志物。目前应用代谢组学已在癌症、心血管病、糖尿病、精神分裂症等疾病中发现重要的生物标志物,加深了对疾病机理的理解,并成功用于疾病的诊断和分型。但是代谢组学在脑性瘫痪研究中的应用尚未见报道。蛋白质组学(Proteomics)是系统生物学的有机组成部分,其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。蛋白质组学是筛选疾病标志物的有效手段。目前这种方法还没有应用在人类脑瘫生物标记物的研究中。结合上述研究现状,本研究采用早期a EEG监测、早期rh EPO治疗,并基于代谢组学和蛋白质组学技术,通过大样本临床试验和基础试验相结合的方法,探索早产儿不良神经预后的早期评估和防治手段。第一部分振幅整合脑电图对极早早产儿脑损伤及不良神经预后的早期评估价值目的本研究探讨a EEG对极早早产儿脑损伤的早期评估和预测远期不良神经预后的效果,并与头颅超声及MRI比较,探讨较佳的早期评估方法,为早期干预提供依据。方法从2012年1月至2013年1月,共346例胎龄小于32周、生后2小时内入住新生儿重症监护病房的早产儿,排除先天性颅脑畸形、染色体病、遗传性及代谢性疾病后纳入本研究。a EEG于出生后72h内监测;头颅超声于生后3天内进行第1次检查,以后每周复查1次直至生后4周;头颅MRI于纠正胎龄40周时检查。早产儿管理按照诊疗常规进行。出院随访至纠正胎龄18个月,运用Bayley婴幼儿发展量表评价认知及运动发育,记录有无脑瘫、严重视力或听力障碍、智力低下、死亡等不良神经预后。结果出生后72h内a EEG重度异常(p=0.000)及a EEG评分<5分(p=0.006)均与早产儿脑白质损伤呈正相关,但a EEG异常与颅内出血无关(p=0.186)。a EEG、头颅超声、头颅MRI重度异常均与纠正胎龄18个月时的不良神经预后呈正相关。a EEG和MRI联合对不良神经预后的预测效果与三项检查联合的预测效果相同,即敏感性52.4%、特异性96.2%、阳性预测值78.6%、阴性预测值88.4%,且均优于单项检查。结论出生后72h内a EEG重度异常可以早期预测极早早产儿脑白质损伤和远期不良神经预后的发生。因此,a EEG可作为新生儿重症监护病房监测极早早产儿脑功能的早期指标。第二部分促红细胞生成素对极早早产儿不良神经预后的防治效果目的本研究旨在探讨早期反复小剂量rh EPO对极早早产儿远期不良神经预后的防治作用及其安全性,并观察rh EPO在血液及脑脊液中的药代动力学。方法采用前瞻性随机对照的试验方法,从2009年1月至2013年6月,共800例胎龄≤32周、生后72小时内入住新生儿重症监护病房的早产儿,排除先天颅脑畸形、染色体病、遗传代谢病、Ⅲ-Ⅳ级颅内出血(随机分组前)、红细胞增多症、严重感染、生命体征不稳定后纳入本研究,并随机分成rh EPO组和对照组。rh EPO组于生后72小时内静脉注射rh EPO 500u/Kg,隔日一次,共2周;对照组给予等体积的生理盐水,疗程同rh EPO组。出院随访至纠正胎龄18个月,主要观察指标为死亡及中重度神经功能障碍的发病率。在rh EPO组随机选择60例胎龄29-30周的早产儿并随机分成6组,每组各10例。在rh EPO初次给药前(0h)及给药后3h,6h,12h,24h,48h分别采集静脉血和脑脊液,采用酶联免疫吸附法批量测定血清、脑脊液中EPO的浓度。结果纠正胎龄18个月时,rh EPO组早产儿死亡和中重度神经功能障碍的发病率(43/330,13%)显著低于对照组(91/338,26.9%)(OR=0.40[95%CI=0.27–0.59],p<0.001)。亚组分析显示rh EPO治疗对不同胎龄(<28w,28–296/7w,30–32w)、不同出生体重(<1000g,1000-1499g,≥1500g)、不同性别的早产儿均具有神经保护作用(p<0.001)。rh EPO组早产儿早期并发症如III–IV级颅内出血(OR=0.38[95%CI=0.23–0.62],p=0.000)、脑室周围白质软化(OR=0.52,[95%CI=0.35–0.79],p=0.002)、坏死性小肠结肠炎(OR=0.44[95%CI=0.27–0.73],p=0.001)、败血症(OR=0.65,[95%CI=0.46–0.92],p=0.015)的发病率显著低于对照组,且未见其他副作用发生。血清(480.32±7.97 m IU/ml)及脑脊液(42.77±8.42 m IU/ml)中的EPO水平均于初次给药后3h达峰值,且两者呈正相关(相关系数r为0.881,p<0.05)。结论1.早期反复小剂量rh EPO治疗能降低极早早产儿发生远期不良神经预后的风险,且无明显副作用。2.EPO能通过早产儿的血脑屏障。第三部分代谢组学在早产儿脑性瘫痪研究中的应用目的本研究运用代谢组学的方法鉴定早产儿脑性瘫痪的代谢物特征,探索脑瘫的发病机理,寻找可用于诊断的生物标志物。方法疾病组选择年龄在12-36个月之间的早产脑性瘫痪儿童,出生胎龄<37周,且均患有脑室周围白质软化;正常组选择相同年龄阶段的无神经系统疾病的早产儿童,采用基于GC-TOF-MS平台的非靶向代谢组学方法,观察两组儿童的血液代谢物,通过单变量分析、多变量分析和生物信息学富集分析,鉴定早产儿脑性瘫痪的代谢物变化。结果我们采集到11例早产脑瘫儿童和11例早产正常儿童,一共检测到177种差异代谢物,最终用于生物信息学分析的代谢物共42种。与正常早产儿童相比,早产脑性瘫痪儿童的血液中肌苷和能量代谢通路出现了异常,表现为肌苷的含量明显降低,乌头酸的含量明显增加,三羧酸循环功能受损,磷酸戊糖通路及半乳糖代谢通路活化。OPLS-DA分析一共得到1+3个主成分,第一主成分能够将早产脑瘫儿童与早产正常儿童清晰地区分开来,代表预测能力的Q2值为0.66,成功建立定量诊断模型。结论代谢组学方法加深了我们对早产儿脑性瘫痪在能量和物质代谢方面的了解,有助于我们对其发病机制的理解。定量诊断模型的建立为早期评估早产儿脑性瘫痪提供依据。第四部分蛋白质组学在早产儿脑性瘫痪研究中的应用目的采用蛋白质组学技术鉴定早产儿脑性瘫痪的差异表达蛋白质,探索脑瘫的发病机理及早期诊断生物标志物。方法疾病组选择年龄在12-36个月之间的早产脑性瘫痪儿童,出生胎龄<37周,且均患有脑室周围白质软化;正常组选择相同年龄阶段的无神经系统疾病的早产儿童,采用基于i TRAQ技术的蛋白质组学平台,鉴定两组儿童血浆中的差异蛋白质,通过GO注释和富集分析,进一步理解差异蛋白质的功能和相关通路。结果我们采集到11例早产脑瘫儿童和11例早产正常儿童,共鉴定了819个差异表达蛋白质,并得到66个显著差异蛋白质。GO功能分析结果显示,差异蛋白质主要参与抗氧化、催化活动、转运、受体、细胞粘附、细胞周期、生长发育、免疫、代谢等生物学过程。通路富集分析显示差异蛋白质与整合素信号通路、细胞骨架调节通路、趋化因子和细胞因子介导的炎症信号通路有关,这些通路可能参与了早产儿脑瘫的发病过程。结论差异蛋白相关信号通路加深了我们对脑瘫发病机理的理解,这些差异蛋白有助于提高脑性瘫痪早期诊断准确性,并可能成为治疗的潜在靶点。