目的一、合成归巢肽CREKA并验证其对肿瘤间质纤维蛋白的靶向性,为进一步的探针制备和肿瘤靶向成像奠定基础。二、制备聚乳酸包被的超顺磁性氧化铁纳米粒SPIO-PLA和靶向性分子探针SPIO-PLA-CREKA,通过理化性质的表征及体外纤维蛋白凝块的磁共振成像实验,探讨SPIO-PLA-CREKA作为磁共振靶向对比剂的可行性。三、通过小鼠肿瘤模型的体内磁共振成像实验,评价靶向性分了探针SPIO-PLA-CREKA对肿瘤的诊断价值。方法一、归巢肽CREKA的合成和靶向性验证1、归巢肽CREKA的合成以Wang树脂为载体,配合Fmoc氨基保护策略,固相合成五肽CREKA.第一个氨基酸与树脂的连接采用对称酸酐法,反应结束后用适量的吡啶和乙酸酐封闭树脂上剩余的活性位点。后续氨基酸以HOBt/HBTU/DIEA为缩合剂依次连接。反应完成后,以三氟乙酸为主切割试剂将目的肽段从树脂上裂解下来。合成产物经高效液相色谱分离、纯化、分析,质谱分析鉴定。2、异硫氰酸荧光素(FITC)标记CREKA在合成五肽CREKA的终末,即最后一位氨基酸半胱氨酸缩合反应完成后,用同样的方法将一个手臂氨基酸6-氨基己酸(Ahx)连接到树脂肽的氨基端。通过FITC与Ahx上的氨基反应,将FITC标记在五肽CREKA的氨基端,生成终产物ITC-Ahx-CREKA。反应完成后,以三氟乙酸为主切割试剂将目的肽段从树脂上裂解下来。合成产物经高效液相色谱分离、纯化,质谱分析鉴定。3、FITC-Ahx-CREKA与血浆纤维蛋白凝块体外结合实验取人鲜血约10ml,用0.4%枸橼酸钠抗凝；2500rpm离心10min,除去血细胞,收集血浆再次离心除去剩余的血细胞,收集血浆置-80℃冰冻片刻。向血浆内加入氯化钙(CaCl2)溶液至Ca2+浓度为20mmol/L。混匀后放置于37℃恒温水浴,直到凝块形成。制备的血浆蛋白凝块用磷酸盐缓冲液(PBS)反复清洗、离心,除去表面残留的各种血清蛋白。将血浆纤维蛋白凝块6等分,随机平分为两组,一组浸于FITC-Ahx-CREKA的PBS溶液,另一组浸于PBS中,放37℃恒温水浴30min。取出凝块,并用PBS反复清洗,离心,除去未结合的FITC-Ahx-CREKA.紫外灯照射35秒后,荧光显微镜下观察并照相。4、FITC-Ahx-CREKA与肿瘤组织切片体外结合实验取福尔马林固定的裸鼠卵巢癌移植瘤(SKOV-3)组织一块,用OTC包埋后作3μm厚的冰冻切片,附贴于洁净的载玻片上,固定。固定好的SKOV-3组织冰冻切片,去离子水冲洗。用FITC-Ahx-CREKA溶液孵育组织片30min,去离子水清洗3次,去除未结合的FITC-Ahx-CREKA。用紫外灯照射35秒后,荧光显微镜下观察并照相。然后将SKOV-3组织冰冻切片做HE染色。5、小鼠肾癌Renca细胞的培养和动物模型的建立小鼠肾癌Renca细胞复苏后,以DMEM完全培养基培养于细胞培养箱。在37℃、5%CO2条件下培养48h后,用胰蛋白酶消化,台盼蓝染色并计数,细胞存活率在98%以上。无菌选取对数生长期瘤细胞,消化离心后弃去上清,加生理盐水洗涤,800rpm离心5min,弃上清,重复洗涤一次；生理盐水调整细胞浓度至106/ml。Balb/c小鼠左侧后背部皮肤常规消毒后,将细胞悬液接种至小鼠左侧后背部皮下,每只小鼠接种O.1ml。常规饲养条件下饲养。6、FITC-Ahx-CREKA与肿瘤组织体内结合实验皮下荷Renca’肾癌移植瘤Balb/c小鼠,肿瘤直径约1.0cm时,尾静脉注射FITC-Ahx-CREKA200μg/0.1ml生理盐水。6小时后处死小鼠,取肿瘤组织,一半液氮冷冻,做冰冻切片,荧光显微镜下观察并照相；另一半福尔马林固定,石蜡包埋切片,HE染色。二、SPIO-PLA-CREKA的制备、表征和体外成像1、SPIO-PLA-CREKA纳米粒的制备和表征(1) SPIO-PLA的制备将0.39g FeCl2·4H2O和1.08g FeCl3.6H20溶于20ml去离子水中,配成Fe2+和Fe3+摩尔比1：2的反应溶液。向反应体系加入适量的左旋聚乳酸(PLA),磁力搅拌器剧烈搅拌下,缓慢滴加氢氧化钠(NaOH)溶液至pH值为10；密闭反应容器,室温下剧烈搅拌过夜。反应溶液依次用转速为1000、5000、10000、15000rpm梯度离心,收集上层悬液。悬液用截留分子量10000的透析袋透析,透析液为标准PBS,每24h更换透析液一次,在4℃条件下共透析3天,除去多余的PLA。透析后获得的SPIO-PLA经0.22μm微孔滤膜过滤除菌,滤过液分装,密封后放置4℃冰箱保存备用。(2)SPIO-PLA-CREKA的制备称取1.20mg EDC-HCl,用100μl碳酸盐缓冲液(pH值8.3)溶解后,在磁力搅拌器搅拌下滴加到1m1的SPIO-PLA悬液中；再取1.27mg sulf-NHS,用100μl碳酸盐缓冲液(pH值8.3)溶解后,滴加到反应体系；持续搅拌反应10min。将5.0mg CREKA用500μl碳酸盐缓冲液(pH值8.3)溶解后,滴加到反应体系,搅拌反应2h。反应液经分子筛柱层析(Sepharose4Fast Flow,GE)分离、纯化。纯化后的SPIO-PLA-CREKA经0.22μm微孔滤膜过滤除菌,滤过液分装,密封后存放于4℃保存备用。(3) SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA的表征H-600型透射电镜观察SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA的形态和大小。用HYL-1080型激光粒度分布仪V2.0测定SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA的粒径及分布。红外光谱仪检测干燥后的SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA,对比分析二者的红外吸收光谱。(4)MR成像实验和T2弛豫时间测定配制6管铁浓度分别为的0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mmol/L的SPIO-PLA-CREKA和SPIO-PLA悬液。Philips Achieva1.5T磁共振扫描仪获得SE序列T2WI图像,评价负性强化效果。并测定各管的T2弛豫时间。T2WI扫描条件：TR:527.3, TE:50ms, FOV:230×230mm, matrix:256X205,层厚：5mm。T2时间测定：TR：2000ms；TE：30-960ms,32回波,FOV：230×230mm,matrix：256×205,层厚：2mm,带宽：40；激发次数为3次。2、血浆纤维蛋白凝块的体外MR成像实验制备13个血浆纤维蛋白凝块,方法：取13个试管,每管内10ml抗凝后血浆；然后再向每管内加CaCl2溶液至浓度为20mmol/L,混匀后置37℃水浴4h；待凝块形成后用3500rpm离心10min,弃去上清；PBS反复清洗、离心,去除表面残留的各种血清蛋白。将血浆纤维蛋白凝块随机分为SPIO-PLA组和SPIO-PLA-CREKA组,每组6管,剩余一个为空白对照管。SPIO-PLA组再随机分为SPIO-PLA1h和SPIO-PLA6h两亚组,各3个管；SPIO-PLA-CREKA组也随机分为SPIO-PLA-CREKA1h组和SPIO-PLA-CREKA6h两亚组,各3个管。SPIO-PLA1h组3个管分别加入浓度为1.6、0.8、0.4mmol/L的SPIO-PLA悬液0.5ml,置37℃水浴1h；SPIO-PLA6h组3个管分别加入浓度为1.6、0.8、0.4mmol/L的SPIO-PLA悬液0.5ml,置37℃水浴6h；SPIO-PLA-CREKA1h组分别加入浓度为1.6、0.8、0.4mmol/L的SPIO-PLA-CREKA悬液0.5ml,置37℃水浴1h；SPIO-PLA-CREKA6h组分别加入浓度为1.6、0.8、0.4mmol/L的SPIO-PLA-CREKA悬液0.5ml,置37℃水浴6h。空白对照管不作对比剂处理。孵育后,所有凝块经PBS反复清洗、离心,除去未结合的对比剂。Philips Achieva1.5T磁共振扫描仪,TSE序列采集T2WI图像,TR：4015.3ms,TE:110ms, FOV:23O×230mm, matrix:256×205,层厚：2mm。3、抑制实验新鲜血浆制备9个血浆纤维蛋白凝块,方法同上,分别放入9个小的离心管内,随机分为A、B、C组,每组3管。先取5mg CREKA肽,用1.5ml PBS溶解,加到A组的3个管内,每管0.5ml。B组和C组各管均加0.5ml PBS。然后分别向A、B组各管加入铁浓度为1.6mmol/L的SPIO-PLA-CREKA,各0.5ml；C组各加0.5ml铁浓度为1.6mmol/L的SPIO-PLA。三组凝块均置37℃水浴1h。取出血浆纤维蛋白凝块,用PBS反复清洗。Philips Achieva1.5T磁共振扫描仪,TSE序列采集T2WI图像,具体扫描参数同上。三、肿瘤间质靶向磁共振分子成像1、小鼠肾癌Renca细胞培养和动物模型的建立小鼠肾癌Renca细胞培养于适量DMEM完全培养基,37℃、5%CO2细胞培养箱内培养48h后,用胰蛋白酶消化,台盼蓝染色并计数,细胞存活率在98%以上。无菌选取对数生长期瘤细胞,消化离心后弃去上清,加生理盐水冲洗,800rpm离心5min,重复洗涤一次；生理盐水调整细胞浓度至106/ml。常规消毒皮肤后,将细胞悬液接种至Balb/c小鼠左侧后背部皮下,每只小鼠接种0.1ml。常规饲养14-18天,待皮下肿瘤结节形成并长大至直径1.5cm左右时成像。2、小鼠肾癌模型的MR成像将皮下荷Renca肾癌移植瘤Balb/c小鼠随机分为实验组和对照组。用戊巴比妥钠(30mg/kg)按体重腹腔注射麻醉小鼠。将麻醉后小鼠固定于自制泡沫鼠床上,平扫获得T2WI图像。增强扫描：实验组小鼠尾静脉注射SPIO-PLA-CREKA,剂量为5mg Fe/kg体重；对照组小鼠尾静脉注射SPIO-PLA,剂量为5mg Fe/kg体重。分别采集对比剂注射后60min、120min、180min各时间点两组小鼠增强数据,观察各时间点肿瘤增强情况。Philips Achieva1.5T磁共振扫描仪,膝关节线圈,TSE序列T2WI横断面扫描：TR:3047ms, TE:100ms, FOV:230×230mm,层厚：5mm,matrix：256×205。图像分析：测量感兴趣区(Region of interest,ROI)内信号强度(signal intensity,SI),计算肿瘤在对比剂注射前和注射后各时间点的信噪比(signal to noise ratio,SNR)。方法：在肿瘤内勾画尽可能大的ROI,测量ROI内信号强度,每个肿瘤测量3次,取平均值,记为SIt;在与肿瘤同层面背景区域选取较大的ROI,测量背景噪声SIn。计算两组肿瘤组织的信噪比SNR=SIt/SIn。3、统计学分析采用SPSS13.0统计处理软件。SPIO-PLA-CREKA和SPIO-PLA增强前后不同时间点肿瘤SNR的比较采用重复测量方差分析。组内增强前后各时间点肿瘤SNR的多重比较采用Bonfferoni法。增强前和增强后各时间点两组间SNR的比较采用两样本均数比较的t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。4、组织病理学检查磁共振扫描结束后处死小鼠,切取肿瘤组织,用福尔马林固定,石蜡包埋。将石蜡包埋组织块置切片机组织支承器上,做3μm厚的组织切片,置于洁净的载玻片上,37℃干燥过夜。分别做HE染色,普鲁士蓝染色和伊红复染。结果一、归巢肽CREKA的合成和靶向性验证1、归巢肽CREKA的合成固相合成的归巢肽CREKA为白色粉末。经质谱分析鉴定,主峰分了量(m/z：[M+H]+)为606.0,与CREKA的理论分子量604.71相符,证明合成正确。经HPLC纯化、分析,合成的CREKA纯度为99.65%。2、FITC-Ahx-CREKA的合成FITC通过Ahx连接到五肽CREKA的氨基端,形成荧光肽FITC-Ahx-CREKA。合成产物为淡黄色粉末,经质谱分析鉴定,主峰分子量为(m/z：[M+H]+)1108.5,与FITC-Ahx-CREKA的理论分子量1107.61相符,证明合成正确。经HPLC纯化分析,合成的FITC-Ahx-CREKA的纯度为98.13%。3、FITC-Ahx-CREKA与血浆纤维蛋白凝块体外结合实验经FITC-Ahx-CREKA溶液孵育的血浆纤维蛋白凝块,经PBS清洗除去未结合的FITC-Ahx-CREKA后,在荧光显微镜下可见绿色荧光,空白对照血浆蛋白凝块无绿色荧光,证明FITC-Ahx-CREKA可以与血浆纤维蛋白凝块特异性结合。4、FITC-Ahx-CREKA与肿瘤组织体外结合实验SKOV-3组织冰冻切片经FITC-Ahx-CREKA(?)呼育后,PBS清洗去除非特异性结合的FITC-Ahx-CREKA,荧光显微镜下肿瘤组织切片内见环状绿色荧光。HE染色证实FITC-Ahx-CREKA的绿色荧光出现的部位为肿瘤血管壁和血管周围间质。5、小鼠Renca肾癌模型的建立6只Balb/c小鼠皮下接种小鼠Renca细胞,饲养14天后,有4只小鼠左侧后背部皮下可触及瘤结节,1只未见肿瘤生长,1只肿瘤沿皮肤生长,皮肤表面破溃,未形成瘤结节。6、FITC-Ahx-CREKA与肿瘤组织体内结合实验荧光显微镜下见冰冻切片肿瘤组织内见大量绿色荧光,呈弥漫性分布,而正常组织内未见绿色荧光。石蜡切片HE染色,肿瘤细胞有明显异型性,核大深染,有明显核仁,可见较多病理性分裂像。证实靶向分了探钊FITC-Ahx-CREKA在活体内可以与肿瘤组织特异性结合。二、SPIO-PLA-CREKA的制备、表征和体外成像1、SPIO-PLA-CREKA纳米粒的制备和表征所制备的SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA均为棕黑色悬液,原子吸收分光光度法测定铁含量分别为182.8mmol/L和167.4mmol/L。透射电子显微镜下见制备的SPIO-PLA和SPIO-PLA-CREKA纳米颗粒呈球形壳核结构,即氧化铁颗粒核心包裹在较厚聚乳酸内,大小均匀。红外光谱分析证实SPIO-PLA成功标记CREKA。粒度分析仪测定SPIO-PLA纳米粒中位粒径124mm,体积平均粒径为133nm,面积平均径85nm,均匀性0.461。SPIO-PLA-CREKA中位粒径136nm,体积平均粒径为150nm,面积平均径88nm,均匀性0.507。不同浓度SPIO-PLA-CREKA和SPIO-PLA悬液经MR扫描SE序列T2WI图像显示：SPIO-PLA及SPIO-PLA-CREKA悬液的T2信号均随浓度的增加而减低。同浓度条件下SPIO-PLA-CREKA靶向对比剂的T2信号强度低于SPIO-PLA。T2时间测量结果显示：随着对比剂浓度的增高,T2时间逐渐缩短。同浓度条件下SPIO-PLA-CREKA靶向对比剂的T2值小于SPIO-PLA。说明本实验制备的SPIO-PLA对比剂及SPIO-PLA-CREKA靶向对比剂均具有负性造影效果,并存在一定的浓度效应关系,即在一定浓度范围内,浓度越高,T2WI负性强化作用越明显。2、血浆纤维蛋白凝块的体外MR成像在T2WI图像上,SPIO-PLA组血浆蛋白凝块的信号强度与空白对照管无明显差别。SPIO-PLA-CREKA组血浆蛋白凝块的信号强度明显低于空白对照管,且随着浓度的增高,信号降低越明显。SPIO-PLA-CREKA组的两个亚组中,6h组的信号强度明显低于1h组。3、抑制实验只用SPIO-PLA-CREKA孵育的血浆纤维蛋白凝块信号强度较SPIO-PLA对照管明显减低,而游离的CREKA和SPIO-PLA-CREKA共同孵育的血浆纤维蛋白凝块信号强度较SPIO-PLA轻度减低。三、肿瘤间质靶向磁共振分子成像1、小鼠肾癌肿瘤模型的建立15只Balb/c小鼠左侧后背部皮下接种Renca肾癌细胞悬液,饲养14天后,有12只小鼠接种部位可触及瘤结节,18天后,肿瘤增大至直径1.5cm左右,用游标卡尺精确测量,移植瘤平均最大径为1.45±0.43cm。建模成功率80%(12/15)。2、小鼠肾癌模型的MR成像TSE序列T2WI扫描结果显示,平扫肿瘤呈均匀的高信号。增强扫描,实验组小鼠尾静脉注射SPIO-PLA-CREKA后,肿瘤信号强度逐渐减低；对照组小鼠尾静脉注射SPIO-PLA后,肿瘤信号强度无明显变化。统计学分析,对比剂注射前后肿瘤SNR有显著性差异(F叫间=88.249,P<0.001)。对比剂和时间之间存在交互效应(F对比剂×时=59.462,P<0.001)。SPIO-PLA-CREKA组肿瘤的SNR显著低于SPIO-PLA组(F对比例=33.097,P<0.001)。增强前后各时间点两组间SNR的比较：注射前及注射后60min,SPIO-PLA-CREKA组和SPIO-PLA组间肿瘤SNR均无显著性差异(30.08±0.66vs.30.13±0.76,t=0.122,P=0.905;29.48±0.82vs.29.97±0.85,t=1.002,P=0.340)；注射对比剂后120min, SPIO-PLA-CREKA组肿瘤SNR显著低于及SPIO-PLA组(27.37±1.14vs.29.62±0.68,t=4.159,P=0.002)；注射对比剂后180min, SPIO-PLA-CREKA组肿瘤的SNR显著低于SPIO-PLA组(24.22±0.48vs.29.53±0.56；t=17.652,P<0.001)。3、组织病理学检查显微镜下见SPIO-PLA-CREKA组未染色肿瘤组织切片血管壁及血管周围出现大量褐色铁颗粒沉着,沿血管弥漫性分布,而正常组织内未见铁颗粒沉着。普鲁士蓝染色见肿瘤组织内血管壁及血管周围颗粒蓝染,微细血管清晰可见；普鲁士蓝染色后伊红复染,肿瘤细胞染为红色,沿肿瘤微细血管弥漫性分布的蓝染颗粒更加清晰。证实SPIO-PLA-CREKA靶向对比剂在活体内可以与肿瘤间质特异性结合,其结合部位为肿瘤组织内血管壁及血管周围间质。结论1、成功合成了归巢肽CREKA,纯度达到99.65%,可满足实验要求；2、成功制备了FITC-Ahx-CREKA,纯度为98.13%,达到体内及体外实验的要求;3、FITC-Ahx-CREKA与血浆纤维蛋白凝块、肿瘤组织体外及体内结合实验均证明归巢肽CREKA可特异性靶向肿瘤间质内纤维蛋白；4、制备了聚乳酸包被的超顺磁性氧化铁纳米粒SPIO-PLA,所制备的SPIO-PLA纳米颗粒呈球形壳核结构,大小均匀,分散性好,无聚集和重叠。在T2WI上具有负性强化效果；5、制备的SPIO-PLA-CREKA呈球形壳核结构,大小均匀,分散性好,静置后无分层。具有明显缩短T2时间的作用,产生T2WI负性强化效果,可作为T2对比剂；6、靶向性探钊SPIO-PLA-CREKA能与凝结的血浆纤维蛋白特异性结合,证明标记SPIO-PLA后的CREKA仍保持原来的生物活性；7、成功建立了Balb/c小鼠Renca(?)肾癌皮下移植瘤模型；8、SPIO-PLA-CREKA引入肿瘤动物模型体内,经MR成像可见肿瘤T2信号减低；9、病理学检查证实SPIO-PLA-CREKA特异性靶向肿瘤间质纤维蛋白,证明SPIO-PLA-CREKA在肿瘤靶向磁共振分子成像中具有良好的应用前景。