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目的：乳腺癌是世界上最常见的女性恶性肿瘤，目前对其诊断治疗的手段已有很大的进展，但仍不能满足临床上早期诊断的要求，需要寻找与之相关的新的诊断指标，以便使乳腺癌得以早期发现和早期治疗。本研究从2.5×109个转染stat3基因的Sf21细胞中纯化Stat3蛋白，制备了高效价特异性的抗Stat3抗体，并应用此抗体进行对乳腺癌早期诊断的初步研究，从分子水平揭示了乳腺癌的发病机制。为乳腺癌早期诊断提供一个的新指标，为治疗开辟一新的途径。方法：将带有重组鼠源性stat3基因的杆状病毒转染Sf21细胞，于28℃培养48h，收集细胞，用超声波破碎仪裂解细胞，提取裂解液中总蛋白，用Yellow-3凝胶亲和层析柱和Toyopearl-AF-Heptin-650M凝胶亲和层析柱分离、纯化Stat3蛋白。层析液中Stat3蛋白的存在和性质，用SDS-PAGE、免疫印迹实验鉴定。应用纯化的人工重组小鼠Stat3蛋白，常规免疫雄性家兔制备抗Stat3抗体。用ELISA方法检测抗体的效价。用饱和硫酸胺盐析，并经透析、DEAE-32层析柱纯化所分离的血清，收集洗脱液，测OD 280值，用SDS-PAGE、免疫印迹法检测Stat3抗体的纯度和特异性。用纯化Stat3抗体检测乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中Stat3蛋白的表达；应用免疫组化染色法，检测乳腺组织中Stat3蛋白的表达。应用RT-PCR方法，检测乳腺癌细胞株<WP=5>MCF-7和MDA-MB-231 Stat3的mRNA表达情况。检测乳腺癌组织和正常乳腺Stat3蛋白的mRNA表达情况。RT-PCR产物经Gel-pro凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析，用IOD(integrated optical density)表示凝胶谱带的面积×荧光强度值，stat3/?-actin 比值代表各mRNA相对表达水平。结果：(1)蛋白的制备:我们将stat3重组于粘虫卵巢细胞（Sf21细胞），从2.5×109个Sf21细胞中提取了200mg Stat3蛋白质。为了减少蛋白降解或活性丧失，迅速进行了层析分离。首先经Yellow-3层析柱分离，得到含有Stat3蛋白的层析成分，该成分在50-150mmol/L盐浓度梯度之间被洗脱。蛋白印迹分析结果显示，蛋白质峰含有Stat3蛋白（分子量为92KDa）。将Yellow-3层析分离得到的Stat3成分进一步用Toyopearl AF-Heptin-650M层析柱纯化，在19-24层析成分中被分离出来，与理论Stat3的分子量吻合，得到纯的Stat3。该成分的NaCl洗脱液浓度为50-80mmol/L。经SDS-PAGE分离，蛋白印迹实验证实，分子量92KDa处的蛋白条带为Stat3。共得到6.68mg Stat3，纯度高于95%。(2)兔抗Stat3抗体的制备及应用:用重组小鼠Stat3蛋白免疫家兔，6W检测后静脉血中抗Stat3抗体效价>1:256,000（A450=0.40）。采取血清并纯化Stat3抗体，将Stat3蛋白经SDS-PAGE分离，可见1条相对分子质量（Mr）为92,000的蛋白条带。用纯化的抗Stat3抗体做免疫印迹证实，于92,000处有明显的带，证明该抗体是抗Stat3特异性抗体。乳腺组织切片经Stat3抗体免疫组化染色,在正常乳腺组织细胞胞浆中呈棕黄色云雾状着色，胞核不着色或着色很浅。而在低分化的乳腺癌组织<WP=6>中癌细胞胞浆被Stat3抗体染色呈棕色云雾状，在胞核则呈深棕色颗粒状；在高分化乳腺癌组织的癌细胞中胞浆呈棕黄色云雾状，胞核呈棕色颗粒状着色。SDS-PAGE和免疫印迹实验结果显示乳腺癌细胞株MCF-7, MDA-MB-231中Stat3蛋白呈高表达。(3)乳腺癌组织细胞中Stat3蛋白的mRNA表达:乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231 Stat3的mRNA高表达。总mRNA的Stat3/β-actin的比值分别为：0.953±0.019；0.872±0.026。乳腺癌组织Stat3的mRNA呈高表达，总mRNA的Stat3/β-actin的比值分别为：0.862±0.022；正常乳腺组织Stat3蛋白的mRNA表达很低。总mRNA的Stat3 /β-actin的比值为：0.223±0.022。两者之间有显著性差异(p<0.001)。结论：(1)从2.5×109个转染stat3基因的Sf21细胞中纯化出6.68mg Stat3蛋白，纯度高于95%。这些Stat3蛋白可用于研究Stat3的作用机理、制备抗Stat3抗体和Stat3诊断试剂盒等。(2)制备了高效价特异性兔抗Stat3抗体，用该抗体检测乳腺癌组织Stat3表达结果显示，乳腺癌组织学分级与胞核Stat3的量呈正相关，与胞浆Stat3的量成正相关，Stat3抗体可用于乳腺癌的早期临床诊断和判断预后。同样乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231的Stat3蛋白呈高表达。(3)乳腺癌组织中Stat3的mRNA呈高表达，正常乳腺组织表达量较低，，说明乳腺癌的发生与stat3的mRNA表达变化相关。在乳腺癌发生发展中的基因表达与蛋白表达水平相符合。因此，认为Stat3可做为乳腺癌早期诊断的新指标。 <WP=7>