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一、研究背景:进入21世纪以来,随着工业化程度的增加以及环境污染的加剧,我国恶性肿瘤人群的患病年纪趋于年轻化。在众多恶性肿瘤中,肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。肺癌总体可以分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）,其中,NSCLC又包括鳞癌、腺癌和大细胞肺癌。世界卫生组织的数据显示,肺癌的发病率和死亡率均居于世界恶性肿瘤的首位。据第八届中国肺癌南北高峰论坛发布,预计到2020年中国肺癌的患病人数将达80万,死亡人数达70万。肺癌的治疗手段主要包括手术治疗、放疗、化疗和药物靶向治疗。对于肺癌中占绝大多数比重的非小细胞肺癌而言,放疗是其非常重要且关键的治疗手段。尽管肺癌的放疗已通过不断发展和完善能够日渐精确放疗区域,但由于肺癌组织对放疗的抵抗特性使得放疗剂量相对提高,肺癌周围正常组织不可避免会受到辐射损伤,由此会继发放射性肺炎等副作用,所以加强对提高肺癌放疗敏感性的研究是提升肺癌放疗治愈率的关键所在。近些年,曾经被认为是“转录噪音”的长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）已经被报道与多种癌症存在着紧密联系,能够促进癌症的发生和发展,发挥着类似原癌基因的功能,并且可以影响癌症放疗的敏感性。近来研究发现,LncRNA ANRIL（又称CDKN2B-AS）在肺癌中表达量明显高于正常肺组织,参与促进肺癌的形成和演进过程,并且在其他癌症放疗后表达量升高,发挥着放疗抵抗的作用,但其在肺癌放疗中的作用还未曾有过研究。根据ANRIL的现有研究成果,我们猜想ANRIL不仅能促进肺癌的发展,还能够参与影响肺癌放疗的敏感性。通过前期的预实验我们发现,人肺癌细胞内ANRIL表达量能随γ射线照射剂量的加大和照射后时间的增加而逐渐升高,并且肺癌细胞内ANRIL的升高伴随着肺癌细胞放疗敏感性下降,而敲低ANRIL以后肺癌细胞放疗敏感性明显升高。以上述立题依据和预实验结果为支撑,我们开展了有关LncRNA ANRIL在肺癌放疗增敏中的作用及机制的研究。本课题研究主要包括以下两部分:ANRIL在肺癌放疗增敏中的效应研究和ANRIL在肺癌放疗增敏中的初步机制探索。二、研究内容:（一）ANRIL在肺癌放疗增敏中的效应研究1、肺癌中的ANRIL与电离辐射的关系首先通过RT-PCR（Real-time PCR）检测四种NSCLC细胞和正常肺上皮细胞中的ANRIL的基础表达量,继而检测肺癌细胞在接受60Coγ射线照射后,ANRIL表达量与照后时间和照射剂量之间的关系。2、ANRIL对肺癌放疗敏感性的影响（1）通过慢病毒包装构建ANRIL敲低（knock down,KD）和过表达（over expression,OE）稳转细胞系;（2）在ANRIL-KD细胞系中研究敲低ANRIL产生的放疗增敏效应;（3）在ANRIL-OE细胞系中研究过表达ANRIL产生的放疗抵抗效应;（4）在裸鼠皮下荷瘤模型中验证ANRIL的放疗抵抗效应。（二）ANRIL在肺癌放疗增敏中的初步机制探索1、ANRIL在肺癌细胞内分布情况;2、ANRIL对肺癌细胞60Coγ射线照射后镜下γH2AX、53BP1 foci数量的影响;3、ANRIL对肺癌细胞60Coγ射线照射后DNA损伤反应通路的影响;4、寻找与ANRIL相互作用的蛋白分子;5、筛选与ANRIL相互作用的microRNA分子;6、检测互作microRNA分子对肺癌细胞60Coγ射线照射后DNA损伤反应通路的影响;7、验证互作microRNA分子对肺癌细胞放疗敏感性的影响。三、研究方法:（一）研究ANRIL在肺癌放疗增敏中的效应1、研究肺癌中的ANRIL表达量与电离辐射的关系（1）提取正常肺上皮细胞BEAS-2B和四种NSCLC细胞的RNA,并通过RT-PCR技术检测ANRIL的表达量。（2）H1299细胞接受60Coγ射线后不同时间点或者不同剂量照射后提取RNA,并通过RT-PCR检测ANRIL表达量变化。2、研究ANRIL对肺癌放疗敏感性的影响（1）构建ANRIL敲低（KD）和过表达（OE）稳转细胞系:将ANRIL-KD和ANRIL-OE质粒与病毒包装质粒共转染,并使用病毒上清感染肺癌细胞。（2）研究干扰ANRIL对肺癌细胞放疗敏感性的影响:在ANRIL-KD和ANRIL-OE细胞系内通过克隆形成率检测照射后存活能力、流式细胞仪检测24h凋亡率、CCK-8实验检测24h和48h的增殖能力、彗星电泳检测DNA损伤程度。（3）裸鼠皮下荷瘤模型研究ANRIL的放疗抵抗效应:将ANRIL-OE细胞系以5×106的密度荷在裸鼠左右侧大腿皮下,形成左右自身对照。并在肿瘤形成后进行10Gy局部照射处理,观察记录肿瘤放疗后体积和重量差异。（二）初步研究ANRIL影响肺癌放疗敏感性的机制1、ANRIL在细胞中的分布情况:ANRIL特异性标记的FISH试剂盒。2、ANRIL对肺癌细胞60Coγ射线照射后镜下γH2AX、53BP1 foci数量的影响:细胞免疫荧光检测法。3、ANRIL对肺癌细胞60Coγ射线照射后DNA损伤反应通路的影响:蛋白质免疫共沉淀。4、寻找与ANRIL相互作用的蛋白分子:RNA免疫共沉淀。5、筛选与ANRIL相互作用的microRNA分子:microRNA.org-Targets and Expression数据库、RT-PCR、荧光素酶报告基因法。6、检测互作microRNA分子对肺癌细胞60Coγ射线照射后DNA损伤反应通路的影响:互作microRNA的mimic和inhibitor转染、蛋白质免疫共沉淀。7、验证互作microRNA分子对肺癌细胞放疗敏感性的影响:互作microRNA的mimic和inhibitor转染、克隆形成率法。四、实验结果:（一）研究ANRIL在肺癌放疗增敏中的效应1、ANRIL在四种肺癌细胞中表达量明显高于正常肺上皮细胞,且表达量与电离照射呈显著时间和剂量相关性。2、ANRIL能降低肺癌细胞60Coγ射线照射后凋亡率和DNA损伤程度,提高照射后细胞增殖能力和独立存活能力,发挥增强放疗抵抗的作用;敲低ANRIL以后,细胞的放疗敏感性明显提高,呈现出凋亡率升高、DNA损伤加重、独立存活能力和增殖能力均下降的表现。通过在裸鼠皮下荷瘤后发现,ANRIL过表达组肿瘤的体积和重量均高于NC对照组,在60Coγ射线局部照射处理后,NC组肿瘤体积和重量明显下降,而ANRIL过表达组下降幅度较小,显示出放疗抵抗的特征。（二）初步研究ANRIL影响肺癌放疗敏感性的机制1、敲低ANRIL能够明显抑制60Coγ射线照射后DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）通路的激活,且主要影响以ATR为上游的同源重组修复通路。并且,ANRIL可以通过作用于ATR发挥促进电离辐射后DDR通路激活的作用。2、miR-7-5p和miR-122-5p在肺癌细胞内的表达量与ANRIL呈负相关趋势,并且在60Coγ射线照射后的变化趋势也与ANRIL照后升高的趋势相反,呈照射后明显降低的表现。miR-7-5p和miR-122-5p与ANRIL之间均存在直接相互作用关系,且ANRIL可以通过抑制肺癌细胞中miR-7-5p和miR-122-5p的表达和功能,发挥促进照射后DDR通路激活和增强放疗抵抗的作用。五、结论:肺癌细胞内ANRIL表达量高于正常肺上皮细胞,且电离照射能促进ANRIL的表达升高。对在体裸鼠和体外细胞两个层面的研究说明,肺癌细胞中的ANRIL是造成肺癌放疗抵抗的原因之一,敲低肺癌细胞内ANRIL能降低肺癌细胞的放疗抵抗,使肺癌细胞放疗敏感性增高。在作用机制方面,ANRIL可能通过两个途径协同作用影响放疗敏感性:一、肺癌细胞中ANRIL能通过与ATR的相互作用,参与到肺癌放疗后DNA损伤反应和修复通路中,促进DDR通路激活,发挥放疗抵抗的作用;二、肺癌细胞中ANRIL能通过与miR-7-5p和miR-122-5p的直接作用,解除miR-7-5p和miR-122-5p对照射后DDR通路的抑制,从而降低肺癌放疗敏感性。