红霉素是一种重要的的大环内酯类广谱抗生素,它具有重要的应用价值。红色糖多孢菌是红霉素的主要工业生产菌。尽管红色糖多孢菌的基因组测序已经完成,在菌株基因改造和发酵过程培养工艺优化等方面开展了大量研究,但由于对红色糖多孢菌胞内代谢机制的了解不清楚,造成基因改造与发酵工艺优化相互脱节。新构建的菌株,往往需要从头开始优化培养工艺。在优化过程中发现的线索,又难以直接用于指导下一轮的基因改造。这些问题的存在,导致难于高效提高红霉素产量。本论文首先建立了适用于红色糖多孢菌代谢研究的13C分析平台,包括代谢模型的构建、胞内代谢物可靠获取方法、胞内代谢物浓度及同位素丰度精确分析方法。然后利用该分析平台,初步探讨了添加脯氨酸对红色糖多孢菌代谢的影响,深入分析了正丙醇的代谢机制,找出有可能提高红霉素产量的基因改造靶点,并通过新菌株的构建,验证了基因改造靶点的有效性。首先,建立了红色糖多孢菌代谢物组分析方法。比较并验证了各种胞内代谢物的提取方法的有效性,并通过对红霉素发酵过程中的胞内代谢物浓度的变化进行分析,发现了红霉素合成与胞内代谢物浓度之间的关系。研究结果表明液氮研磨法适合于胞内辅酶A类物质和磷酸糖的提取;沸乙醇法适合于胞内有机酸的提取。胞内代谢浓度分析的结果表明,S.erythraea在从生长期进入稳定期的过程中,TCA循环和EMP的途径的活力都在下降。比红霉素A合成速率与高甲基丙二酰辅酶A和丙酰辅酶A以及许多其它代谢物的浓度是正相关的。丙酰辅酶A的浓度下降是影响红霉素合成的重要原因。此研究使得研究人员可以对S.erythraea在工业发酵过程中的代谢特点进行定量分析。其次,建立并验证了红色糖多孢菌胞内代谢物13C同位素信息分析平台。根据无干扰和信号强的原则挑选出了合适于分析氨基酸13C同位素信息的GC-MS碎片,从而得到可靠的氨基酸同位素信息分析方法。一对多法适合于有机酸同位素信息测定。采用一对一法测定得到的磷酸糖标准品的同位素信息与理论值非常接近,说明磷酸糖测定方法是可靠的。辅酶A类物质标准品同位素信息测定结果表明,一对多法有更高的准确度,而单级SIM(single ion monitoring)法有更好的灵敏度,且两种方法测定结果与理论值都很接近。20%[U-13C]glucose标记实验中,氨基酸、有机酸、磷酸糖和辅酶A的相关方法测定得到的同位素标记信息与理论值都很接近,该结果验证了所构建的同位素信息测定方法在红色糖多孢菌中的有效性。再次,构建用于S.erythraea的13C标记实验方法、平台。包括构建S.erytraea的核心碳代谢网络、代谢反应的原子迁移式、细胞合成反应以及一些代谢物的同位素信息分析方法。通过上述平台的构建,我们对葡萄糖和脯氨酸的胞内代谢进行了定量分析。我们发现葡萄糖ED途径代替了 EMP途径进行葡萄糖代谢。13C代谢通量分析的结果表明培养基中添加脯氨酸后,胞内代谢通量分布发生较大变化,最终降低了菌体代谢负担,促进菌体生长。接着,利用13C标记实验平台找到了工业发酵过程中正丙醇氧化代谢的通路,并对关键靶点进行代谢改造,最终使得红霉素的产量提高了 47%。正丙醇在代谢网络中可能通过两条途径(途径Ⅰ和途径Ⅱ)进行氧化分解代谢。利用[1-13C]丙酸钠进行同位素标记实验,结果表明正丙醇的碳骨架可以通过途径Ⅰ进入TCA循环进行氧化分解代谢,而由于缺乏丙二酰辅酶A脱羧酶的活性,正丙醇不能通过途径Ⅱ进行氧化分解代谢。通过对两个关键靶点(mutB和sucC)的基因敲除都能阻断正丙醇通过途径Ⅰ进行的分解代谢,并且不影响红霉素的合成。对工业菌株S.erythraea E3的相关靶点进行敲除成功构建出工程菌S.erythraea E3-AmutB和S.erythraea E3-AsucC。在摇瓶中,S.erythraeaE3-△mutB的和S.erythraea E3-AsucC的红霉素产量分别是原始菌株的2.23倍和1.25倍。构建的基因工程菌S.erythraea E3-AmutB的和S.erythraeaE3-AsucC的红霉素对正丙醇得率也由原始菌株的0.22分别提高到了 0.48和0.27(g/g)。这些结果说明S.erythraeaE3-AmutB更适合于红霉素的生产。胞内代谢通量分析的结果表明S.erythraea E3-△mutB中代谢反应“甲基丙二酰辅酶A→琥珀酰辅酶A”并未完全终止,而正丙醇向TCA循环转化率从原始菌株的73.1%下降到了 29.8%。本论文在工业菌株的基础上构建的工程菌有望在工业规模提高红霉素的产量和正丙醇的转化率,从而提高工业生产红霉素的效率并降低成本,提高中国红霉素产业的竞争力。最后,采用高通量实验方法和氮磷调控策略设计并系统优化了用于红霉素高效合成的合成培养基。根据菌体生长和红霉素合成的可能需求,设计的初始培养基中含有38种物质。采用高通量实验方法进行单组分删除实验和Plackett-Burman实验将组分数量减少一半,并对各组分浓度进行优化。然后,在5L发酵罐水平上通过对菌体生长的规律进行分析,发现了菌体的二次生长现象,以及不同氨基酸的选择性消耗的时序规律。通过氮磷调控策略,将氨基酸组分再次减少,并得到了最佳的初始磷浓度。最终优化出的合成培养基中红霉素的效价为1380mg/L,比过去研究红色糖多孢菌所采用的合成培养基提高了 17倍,为进一步深入阐述红霉素的代谢机理打下了良好基础。