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在鱼类肌肉蛋白质中,肌球蛋白占肌原纤维蛋白质的50%以上。它是一种普通的真核细胞运动性蛋白,能和肌动蛋白结合形成细胞运动如胞质分裂和肌肉收缩等所需的物质。普通的肌球蛋白一般由两条重链亚基(MHC)和两对不对称的轻链亚基构成,而MHC具有肌球蛋白分子运动马达和细丝形成的作用,可以分为两个功能性结构域:氨基端具有马达功能的头部球状区域和羧基端具有丝状形成能力的一个具有α双螺旋长杆状结构域。而ATPase酶解和肌动蛋白结合位点都位于重链头部区域Subfragment-1(S1)部位的两个表面环附近。草鱼属于广温性的淡水鱼类,它的肌肉功能伴随栖息水温的变化而变化,以至于能够周年生活在温差极大的栖息环境中。淡水鱼所具有的这种独特的温度适应能力与其肌原纤维蛋白质主要是肌球蛋白性质的季节变化是密切相关的,而肌球蛋白的热稳定性通常会影响鱼类肌肉的加工适性。因此本实验选取草鱼作为研究对象,分离和克隆骨骼肌MHC的三种同工型基因,同时通过半定量PCR法初步了解这三种同工型基因伴随温度变化的表达模式,并利用同源建模法对草鱼MHC三维立体结构进行了预测。
1.本研究以自然条件下四个季节的草鱼为材料,提取骨骼肌总RNA,通过运用逆转录PCR并结合RACE法等,成功地获得草鱼三种MHC同工型基因的全长序列。经核苷酸序列分析,10-type cDNA的全长序列为5968bp,编码区域核苷酸长度为5790bp;I-type cDNA的全长序列为5957bp,编码区域核苷酸长度为5799bp;30-type cDNA的序列长度为5898bp,编码区域长度为5802bp。经NCBIblast分析后发现与鲤科鱼类肌球蛋白序列具有很高的同源性,因此认为本实验获得了草鱼骨骼肌肌球蛋白重链三种同工型基因的全长序列。
2.这三种同工型基因分别编码了1930、1933、1934个氨基酸序列。与鲤鱼,兔子等其他哺乳动物的氨基酸序列进行比对分析,1O-type和I-type相似性为87.6%,和30-type的相似性为86.7%,而I-type和30-type的相似性达到了97.5%。另外这三种同工型氨基酸序列跟兔子的MHC全长cDNA比较,相似性分别是80.3%,82.5%,81.9%。10-type氨基酸序列之所以呈现出与其他同工型这些差异,主要是因为全长氨基酸序列共有145个变异位点,约占7.51%,其中S1就占到了97个。同时实验还对MHC中的两个重要区域S1和LMM进行初级结构的分析,结果表明:S1区域中的两个表面环Loop1和I.oop2氨基酸序列的差异引起草鱼肌球蛋白ATPase的热稳定性变化;而LMM区域的28-残基重复排列模式分析图差异也证明了30-type LMM能够形成更为稳定的α-双螺旋结构。与其他哺乳动物做了个系统发育树分析,结果表明了草鱼和鲤鱼MHC的多基因家族与哺乳动物的骨骼肌MHC更具有亲缘关系。
3.同样以自然条件下四个季节的草鱼为材料,提取骨骼肌总RNA,采用了半定量RT-PCR方法检测不同季节草鱼骨骼肌中这三种MHC同工型基因mRNA的变化时发现,冬季草鱼大部分表达的是10-type基因,而春季和夏季草鱼中主要表达了I-type和30-type基因,而秋季则都有表达,但量很少。
4.运用生物信息学工具对草鱼MHC的三级结构进行了预测,获得了直观可视的蛋白质立体图形,对肌球蛋白的研究做了非常有意义的尝试。从预测图形来看,低温型的两个表面环的结构明显不同于另两种同工型,而LMM则完全显示典型的α-双螺旋结构特征。