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菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus, BCMV)为马铃薯Y病毒科(Pot yviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员,病毒粒体呈线状,含有1条正义单链RNA,5’端没有帽子结构但带有病毒基因组结合蛋白VPg,3’端有poly(A)尾;基因组全长约10 kb,包含一个大的开放阅读框,编码一个多聚蛋白,此多聚蛋白经蛋白酶切割产生10个成熟的功能蛋白,其中Nib蛋白具有依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)活性,负责基因组正负链间的复制。 通过RACE技术,克隆来自山东不同地区花生样品中的BCMV 5’UTR及3’UTR序列;发现BCMV的5’UTR及3’UTR序列比较保守,但3’UTR的poly(A)存在长度差异。 通过构建萤火虫荧光素酶(Fluc)的融合载体,分析了BCMV 5’UTR和3’UTR对不依赖帽子翻译的调控作用。①BCMV的5’UTR对翻译有明显的正调控作用,表明其具备IRES活性;突变分析显示其调控翻译的核心区域位于5’末端的第一个大茎环。②3’UTR对5’UTR的翻译正调控起抑制作用,可能原因是3’UTR和5’UTR间存在潜在的RNA-RNA互作。 克隆了山东不同地区花生中的BCMV的Nib编码序列,序列分析表明BCMV Nib氨基酸序列较保守,BCMV不同分离物的RdRp活性存在差异可能性较小。然后,以pMAL-c2x为基础载体,构建了含BCMV青岛分离物Nib编码序列的原核表达载体p MAL-BC-Nib。不同IPTG (0.2~1.0 mM)诱导条件下均可以获得目的蛋白(100 kDa的MBP-Nib融合蛋白)的高水平表达,且37℃条件下目的蛋白可溶性比例最高(约60%);体外复制实验表明此原核表达的MBP-Nib融合蛋白可以特异性识别BCMV基因组链和互补链的3’末端片段,并合成其各自的互补链;说明BCMV Nib具备RdRp活性,且具有区域识别特异性,初步建立了BCMV Nib介导的体外复制体系。