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单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是一种重要的人兽共患病原菌,噬菌体是一类专一寄生的细菌病毒,具裂解循环或溶源循环。PCR及其扩增产物的序列测定显示38株单增李斯特菌分离株中的16株在tRNAArg位点携有原噬菌体，利用丝裂霉素C诱导获得一株溶源性噬菌体，透射电子显微镜观察表明该噬菌体为长尾噬菌体，命名为W001，DNaseI、RNaseA和绿豆核酸酶消化噬菌体基因组的结果确认其核酸为dsDNA。鸟枪法测定W001基因组序列，run-off法确认其基因组末端具有COS位点5’-CGGTGTGGGG-3’, W001基因组全长为42，227个碱基，由66个开放阅读框组成，噬菌体整合核心序列attPP’-AATCCCTCTCAGGACG位于噬菌体整合酶下游。第20个开放阅读框编码全长为281个氨基酸的噬菌体裂解酶PLYW001，该酶由NH2端的催化结构域（EnzymaticallyActive Domain，EAD和COOH端的结合结构域（Cell-wall Binding Domain，CBD）组成,利用大肠杆菌表达并制备裂解酶，Ni柱纯化，Bradford法定量裂解酶蛋白浓度，浊度递减法测定PLYW001的裂解活性和裂解谱，PLYW001可裂解包括噬菌体W001宿主菌HA1073、EGDe、10403s在内的1/2a血清型的单增李斯特菌；氨基酸替换突变研究结果显示位于裂解酶PLYW001催化结构域的7个氨基酸（45R、50Q、64S、66H、73D、115D和118H）与裂解酶活性相关。PCR分别扩增EGFP和裂解酶CBD编码基因，构建载体pET28a-EGFP-CBD，大肠杆菌表达融合蛋白EGFP-CBD，Ni株纯化制备EGFP-CBD，激光共聚焦显微镜观察证明CBD可结合于单增李斯特菌细胞壁。在整合酶作用下，噬菌体基因组DNA以attPP位点特异性整合至宿主细菌基因组DNA的attBB位点。利用噬菌体W001的整合酶构建非李斯特菌复制型质粒pHAL2，并电转化actA/plcB缺失的单增李斯特菌LM-1003感受态细胞，PCR扩增产物的序列测定表明该质粒成功整合至LM-1003基因组特异性tRNAArg位点，因此，质粒pHAL2可用于基因敲除菌株的基因互补。