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番茄斑萎病是一类分布广泛,在许多植物上引起严重症状的病害,由布尼亚病毒科(Bunuyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)典型成员番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)系统侵染引起。Sw-5b 是一个有 CC-(NB-ARC)-LRR 结构的抗病基因,从秘鲁番茄中克隆获得,该抗病基因的番茄可以有效限制TSWV在番茄中的传播,并有轻微的过敏性反应表现。本研究采用转基因技术将番茄抗病基因Sw-5b转入了本氏烟中。首先构建了含番茄抗病基因Sw-5b的载体p2300-Sw-5b,用叶盘法通过农杆菌转化本氏烟,经过组织培养获得转基因本氏烟再生植株,初步进行了分子检测和抗病性鉴定,结果如下:Sw-5b农杆菌表达载体的构建:在本研究中,我们设计了特异性的引物,从抗病番茄中克隆了 3.7kb的Sw-5b基因,通过Smal Ⅰ和Pst Ⅰ位点双酶切插入改造过的农杆菌表达载体p2300(将原来的35S启动子替换为SW-5b的native启动子),构好的载体经过PCR验证后转化至农杆菌GV3101,该农杆菌与含有p2300-Nsm(表达TSWV NSm蛋白)的农杆菌共浸润本氏烟叶片时,能够引起超敏反应(Hypersensitive Response,HR),表明载体构建成功。Sw-5b转基因本氏烟的研究:我们将上述步骤构建的p2300-Sw-5b表达载体使用叶盘法转化至本氏烟,通过T,代和性状分离比判断能发生HR的转基因烟草都是纯合子。使用TSWV接种所得的Sw-5b转基因本氏烟,接种叶片上发生了 HR,7d后,转基因本氏烟生长正常,用系统叶进行了 Dot-blot检测以及提取其总RNA进行了RT-PCR检测,没有检测到TSWV的侵染,证明该转基因本氏烟能有效抵抗TSWV侵染。本研究成功得到了抗TSWV的Sw-5b转基因本氏烟,并证明其能有效抵抗TSWV的系统侵染,具体的抗病机制还待进一步研究。