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神经嵴细胞（neural crest cells,NCCs）是脊椎动物特有的在胚胎发育期短暂存在的一类细胞。随着发育进程,沿着不同的迁移路径迁移到机体的不同部位并在此定植,参与组织器官的发育和功能的完备。然而,神经嵴细胞的迁移受到信号通路和微环境等诸多因素的影响,在这些因素的影响下导致NCC迁移不完全则会导致疾病的发生。其中,先天性巨结肠（HSCR）是由于神经嵴细胞在肠道中的定植不完全导致远端结肠缺乏神经节,从而引起的病变肠段的舒张受限,肠内容物通过不良引起上段结肠内容物聚集,引起巨结肠的表型。目前临床上的治疗手段以手术切除病变肠段或药物干预为主,然而这些传统的治疗手段伴随着并发症、预后不良或复发等弊端。研究表明,干细胞移植有望替代受损肠段的神经,成为一种新型的治疗HSCR的潜在手段。肠神经来源的干细胞（ENSC）或肠神经嵴干细胞（En-NCSC）移植到肠道中展示较好的活力,并分化成肠亚型神经元,产生与肠本身神经元类似的神经递质。近几年的研究表明,ENSC在移植到Nos-/-模型鼠后,肌条的功能检测反应肠动力的恢复。然而ENSC的数量有限,阻碍了其临床应用。鉴于此,基于发育生物学原理,将人多能干细胞（h PSC）用RA和GDNF等重要分子诱导,模拟En-NCSC的分化过程,得到肠神经嵴细胞,再利用干细胞分化而来的肠类器官平台证明功能性神经元的产生。然而,h PSC存在安全性等问题,与临床应用有一定距离。合适的种子细胞的发现与探索仍是HSCR等肠神经疾病干细胞治疗的关键。肠神经系统（ENS）来自迷走神经嵴和骶神经嵴的迁移和定植。神经嵴细胞是具有多能性的一类干细胞,体内其他组织器官如皮肤,毛囊,牙髓等也有神经嵴细胞的定植,但其他部位神经嵴细胞是否具有修复肠神经的潜能的相关研究较少。作为肠神经嵴细胞的同源或近源关系的神经嵴细胞或许具有类似肠神经嵴的功能。迁移前的神经嵴细胞（pNCC）在肠中是否具再生功能性神经元和产生神经依赖的肠运动尚不可知。目的:1.迁移前的神经嵴干细胞（pNCSCs）的获取及体外扩增培养。2.pNCSCs的体外分化能力检测。3.pNCSCs移植到小鼠结肠中分化能力探究。4.pNCSCs对肠动力的控制能力探究。材料及方法:我们首先通过细胞形态及细胞迁移追踪分析和免疫荧光检测P75的表达筛选神经嵴细胞,体外进行扩增,并探究其三系分化和神经元分化能力,并利用膜片钳技术检测其电生理功能。另外,我们将体外扩增的神经嵴干细胞移植到小鼠结肠中,利用免疫荧光手段检测其在体内的肠神经元亚型及神经胶质细胞分化能力,突触形成能力,且利用膜片钳技术检测细胞在体内分化的神经元是否具有产生动作电位的能力。此外,为了进一步检测pNCSCs对肠动力的控制能力,我们将pNCSCs与胚胎干细胞分化而来的肠类器官进行共培养移植到裸鼠肾包膜下成熟为组织工程肠（Tissue Engenieered Intestine,TEI）后进行动力分析,利用轨迹分析软件Tracker来分析TEI的运动,比对有无pNCSCs加入的pNCSCs-TEI和Ctrl-TEI的运动及对药物的反应差异。统计结果用来分析pNCSCs对肠动力的控制能力。结果:1.将孕9天的EGFP的鼠胚神经管取出,贴壁。通过细胞形态和免疫荧光染色P75阳性的细胞筛选出迁移前的神经嵴细胞,体外培养将其扩增,可得到较高纯度的的神经嵴干细胞,细胞形态均一,且表达标志物P75,Sox10,AP2,Nestin。2.移植后的EGFP的pNCSCs在小鼠结肠中体内形成神经网络,部分细胞聚集形成类神经节,免疫荧光结果显示表达EGFP的外源细胞大部分表达神经标志物Tu J1和少量的胶质细胞标志物S100β。3.将扩增中期的细胞移植到小鼠结肠中,免疫荧光结果显示EGFP的细胞在体内2m分化为具有肠神经元神经化学特性的神经元,如一氧化氮合酶NOS,血管活性肠肽VIP,胆碱乙酰转移酶Ch AT。4.EGFP阳性的pNCSCs移植到体内3-5w,利用膜片钳技术检测到EGFP的细胞可产生动作电位,表明细胞在体可分化成功能性神经元。另外移植后的细胞表达突触蛋白标志物Syn-1,显示外源细胞具有建立突触联系的能力。5.将pNCSCs细胞与胚胎干细胞分化而来的肠类器官共培养并移植到裸鼠肾包膜中成熟为组织功能肠（TEI）,通过对pNCSCs-TEI和Ctrl-TEI的运动检测,并利用Tracker软件进行运动轨迹分析,结果显示pNCSCs-TEI和Ctrl-TEI均具有自主蠕动的能力,在甲基蓝的作用下,pNCSCs-TEI的蠕动频率明显下降,但不完全消失,而Ctrl-TEI的蠕动几乎完全被阻断,二者在蠕动频率上具有统计学差异,在蠕动幅度上没有统计学差异。在神经阻断剂TTX的作用下,pNCSCs-TEI运动抑制作用明显,而Ctrl-TEI的运动影响较小,二者对TTX的反应在运动幅度和频率上均具有统计学差异,显示pNCSCs-TEI具有神经依赖的肠动力。6.将pNCSCs与胚胎干细胞分化而来的肠类器官共培养并移植到裸鼠肾包膜中成熟为组织功能肠（TEI）,对pNCSCs-TEI和Ctrl-TEI的运动进行检测,并利用Tracker软件进行运动轨迹分析,结果显示pNCSCs-TEI和Ctrl-TEI均具有自主蠕动的能力,经ICC抑制剂甲基蓝处理后,pNCSCs-TEI的蠕动频率下降,但不完全消失,而Ctrl-TEI的蠕动明显被阻断,二者对ICC抑制剂甲基蓝的反应差异显示pNCSCs-TEI的运动不仅受ICC的控制,还有其他机制的参与。而在神经阻断剂TTX的作用下,pNCSCs-TEI运动抑制作用明显,而Ctrl-TEI的运动影响较小,二者对TTX的反应在有明显的统计学差异,显示pNCSCs-TEI具有神经依赖的肠动力。结论:1.迁移前的神经嵴干细胞（pNCSCs）在体外具有一定扩增能力,具有三系分化能力,且可分化为具有电生理功能的神经元。2.pNCSCs移植到小鼠结肠中可形成神经网络,并可分化成神经元和神经胶质细胞,并表达亚型肠神经元的标志物。3.pNCSCs移植到体内表达突触蛋白标志物Syn-1,显示外源细胞具有形成突触的能力,且移植后的细胞分化成可以产生动作电位的功能性神经元。4.pNCSCs分化而来的神经可调节肠蠕动。