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目的：1.研究蛋白酶活化受体1(Protease-activated receptor1, PAR1)在热打击所致内皮细胞损伤中的作用。2.通过离体细胞实验和动物实验,分别在分子水平上和动物水平上探讨血必净对热打击所致血管通透性的保护作用及其机制。方法：本研究在细胞水平以HUVECs为研究对象,模拟中暑环境,采用细胞培养、跨内皮细胞电阻(TER)测定、免疫印记、免疫荧光等方法,观察热打击对单层HUVECsTER的影响以及热打击之后F-actin形态学的变化,从而确定热打击能否破坏HUVECs的屏障功能,引起HUVECs通透性增高；采用PAR1特异性抑制剂RWJ-56110干预,探讨热打击介导通透性增高的机制；并且观察血必净注射液对热打击所致通透性增高的保护作用。在动物水平上,利用高温仓技术制作C57BL/6J小鼠热打击模型,观察其肺组织和脑组织通透性的变化,以及血必净注射液干预之后对血管屏障功能的保护作用。结果：1.热打击介导单层内皮细胞通透性增高1.1热打击以温度依赖性的方式介导HUVECs通透性增高HUVECs分别在39、41和43℃下热打击3h,测量单层细胞TER。结果发现单层内皮细胞TER呈温度依赖性降低(图1-1.1,表1-1.1),这提示单层HUVECs通透性在热打击下呈温度依赖性增高。1.2热打击以时间依赖性的方式介导HUVECs通透性增高HUVECs分别在43℃下分别热打击1、2和3h,测量单层细胞TER。结果发现单层内皮细胞TER呈时间依赖性降低(图1-1.2,表1-1.2),这提示单层HUVECs通透性在热打击下呈时间依赖性增高。2.热打击通过PAR1介导HUVECs骨架蛋白形态学改变激光共聚焦显微镜下可观察到,正常组的HUVECs呈鹅卵石状,形态饱满,细胞间连接紧密,未见明显缝隙,其F-actin分布在细胞的周边,线条清晰,边界完整连续,而热打击后的HUVECs, F-actin边缘变得模糊粗糙,甚至崩解消散,使用RWJ-56110和血必净注射液干预可有效改善热打击所致细胞骨架形态的上述改变(图1-2)。3.热打击通过PAR1与moesin磷酸化介导HUVECs通透性增加3.1HUCECs在热打击后其PAR1的表达及moesin磷酸化水平随时间推移而增多HUVECs于43℃细胞孵箱内热打击3h,在热打击后及热打击后0.5、1、2、4、6、8、24h分别提取细胞蛋白,western blot检测PAR1和P-moesin表达的变化。结果发现PAR1表达在热打击之后,在不做任何干预和处理的前提下随时间的推移而增多,在第8h时达到最高,在24h有所恢复(图1-3.1,表1-3.2)。3.2热打击以温度依赖性的方式介导PAR1表达增高HUVECs分别在39、41和43℃细胞孵箱内热打击3h, western blot检测PAR1及P-moesin表达的变化。结果发现PAR1和P-moesin表达在热打击之后呈温度依赖性增高(图1-3.2,表1-3.2)。3-3热打击以时间依赖性的方式介导PAR1表达增高HUVECs在43℃细胞孵箱内分别热打击1、2、3和4h, western blot检测PAR1及P-moesin表达的变化。结果发现PAR1及P-moesin表达在热打击之后呈时间依赖性增高(图1-3.3,表1-3.3)。3.4RWJ-56110抑制热打击导致的rnoesin磷酸化把饥饿24h后的HUVECs分为常温对照组,43℃热打击组,43℃热打击RWJ-56110预处理组,RWJ-56110预处理组在热打击前20min加入3μM,热打击3h后,于细胞孵箱内继续培养6-8h,提取细胞总蛋白,westeren blot检测P-moesin表达水平。结果发现,RWJ-56110预处理组moesin磷酸化水平较未处理组表达减少(图1-3.4,表1-3.4)。3.5热打击通过PAR1介导HUVECs通透性增加我们已经发现热打击能够以时间依赖和温度依赖的方式介导PAR1表达增高,为了进一步明确热打击是否通过PAR1介导HUVECs通透性增高,我们采用PAR1的特异性抑制剂RWJ-56110预处理细胞20min,然后进行热打击,测量单层HUVECs的TERO结果发现,与单纯热打击组相比,经过RWJ-56110预处理之后能够显著抑制HUVECs通透性增高。这提示,热打击通过’PAR1介导HUVECs通透性增高(图1-3.5,表1-3.5)。4血必净抑制热打击介导的HUVECs通透性增高用血必净干预后的HUVECs,其电阻值相对于热打击组有上升趋势(图2-1.,表2-1.),组间比较具有显著差异(P<0.05)。5血必净抑制热打击介导的F-actin应力纤维形成在Confocal小皿内培养单层内皮细胞,热打击后以鬼笔环肽对F-actin进行荧光染色,激光共聚焦显微镜下可观察到,正常组的HUVECs呈鹅卵石状,形态饱满,细胞间连接紧密,未见明显缝隙,其F-actin分布在细胞的周边,线条清晰,边界完整连续,而热打击后的HUVECs, F-actin边缘变得模糊粗糙,甚至崩解消散,使用血必净注射液干预可有效减少热打击导致的应力纤维的形成,抑制细胞骨架形态的改变(图2-2)。6血必净抑制热打击介导的PAR1和moesin磷酸化水平增高,且存在剂量效应。按实验分组,在对HUVECs43℃热打击前30min分别加入培养基体积10%、15%、20%、25%的血必净原液,热打击3h后,更换培养基与血必净,孵箱静置8h后提取蛋白,以werstemblot检测PAR1及p-moesin表达水平,结果发现不同浓度的血必净注射液对PAR1及p-moesin表达有不同程度程度的抑制作用(图2.3-1、2.3-2；表2.3-2)。7血必净抑制热打击介导的中暑小鼠肺和脑组织通透性增高伊文氏蓝组织血管染色的结果显示以血必净原液0.4ml/kg提前30min预处理后的C57BL/6J小鼠的肺脏及大脑的OD值,较热打击组明显下降。血必净可显著改善热打击导致的血管通透性增高(图2.4-1,表2.4-1)。8血必净注射液有效改善热打击导致的肺淤血和脑水肿状况使用血必净注射液血必净原液0.4ml/kg提前30min预处理C57BL/6J小鼠,其肺重体重比及脑重体重比热打击组有所下降,提示血必净注射液可有效改善热打击导致的肺淤血和脑水肿状况(图2.4-2,表2.4-2)。9血必净改善中暑小鼠的生存率用血必净注射液血必净原液0.4ml/kg提前30rmin预处理的C57BL/6J小鼠比其他同时间热打击的小鼠体温升高的幅度低(图2-5,表2-5),存活时间长,生存率提高50%(图2-6)结论：1.细胞水平热打击以时间依赖和温度依赖的方式介导HUVECs通透性增高；2.热打击通过PAR1和Moesin磷酸化介导HUVECs通透性增高；3.血必净通透抑制PAR1和P-moesin的表达保护内皮细胞屏障功能；4.动物水平血必净抑制中暑小鼠脑和肺血管通透性增高；5.血必净显著延长了中暑C57BL/6J小鼠的生存率。