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晚期肝细胞癌(简称“肝癌”)在临床上常见,以索拉非尼为代表的抗血管生成药物在晚期肝癌治疗中占重要地位,但其生存期延长有限且多数患者因各种原因需要停药。有报道称,短期抗血管生成治疗后停药具有促进肿瘤转移的潜能。我们前期的动物实验也发现,索拉非尼在显示疗效的同时,促进肝癌局部播散和血道转移,肿瘤内巨噬细胞在其中起重要作用。尽管越来越多的研究提示抗血管生成存在治疗耐药和促进肿瘤转移等负面作用,但多集中以肿瘤细胞和肿瘤微环境的变化来解释该作用。本研究拟在机体内环境方面,揭示两种典型的血管内皮生长因子受体抑制剂(索拉非尼和苏尼替尼)的作用,了解该作用对肝癌转移的影响,揭示其机制并寻求潜在的联合治疗,以减少其负面作用,从而为抗血管生成治疗增效或减少停药后的反跳。本研究中,我们发现：1.为充分暴露药物对机体内环境的作用,我们使用药物预处理模型,即在接种肿瘤前用药,接种肿瘤后停药。抗血管生成药物预处理不影响原位种植肝癌的生长,但可显著促进原位种植的肝癌或尾静脉注射肝癌细胞的肺转移。这与Ebos等(Ebos, et al. Cancer Cell 2009)的报道一致。在我们的研究体系中,只有动物的机体暴露于药物,肿瘤细胞和肿瘤组织未受到药物的直接影响。我们推测,药物可引发裸鼠机体发生某种变化,该变化促进了后来进入体内的肝癌细胞的肺转移。2.使用抗体芯片筛选动物血浆中浓度显著变化的常见炎症因子和血管生成因子,发现药物干预使外周血血浆白介素(IL)-12b(IL-12的一个亚基,又称IL-12p40)浓度显著下降,使用ELISA方法验证了该结果。3.确定IL-12b的器官来源：取动物的肾、肝、脾、肺4个主要脏器,发现这些脏器的il-12b表达均被药物治疗所抑制,其中脾脏il-12b的表达丰度最高。4.确定IL-12b的细胞来源：磁珠分选小鼠脾脏内的巨噬细胞和树突状细胞(DC),发现这两种细胞是il-12b的主要来源(分选后剩余的其他细胞il-12b的表达量较低)。这与传统认识一致,即抗原提呈细胞是表达IL-12的主要细胞类型。5.选择体外培养的巨噬细胞为主要的研究对象,抗血管生成药物在体外可显著抑制THP-1单核-巨噬细胞株的il-12b表达；在此基础上,我们探索在药物预处理促进肝癌转移的现象中,IL-12b表达降低是否是关键原因。6.IL-12b的水平下降是否有促转移作用1)脾脏切除：脾脏il-12b表达量最高,切脾后的动物外周血血浆IL-12b浓度明显低于同期的接受假手术的小鼠。对切脾后的裸鼠尾静脉注射肝癌细胞,可观察到该组动物肝癌细胞肺转移增加；2)小鼠IL-12b中和抗体腹腔注射亦可促进尾静脉肝癌细胞肺转移。这两个实验均重现了抗血管生成药物的促肝癌肺转移作用。7.IL-12b表达的下降如何促进肺转移：体外实验发现,重组IL-12b对肿瘤细胞的增殖和侵袭能力无明显影响；现有知识也提示IL-12主要通过自然杀伤细胞(NK)的细胞毒作用起间接的抗肿瘤作用(Trinchieri, Nat Rev Immunol2003)。我们采用流式细胞仪检测NK的干扰素(IFN)-γ表达,可观察到了抗血管生成药物可以显著抑制动物外周血NK细胞的IFN-y表达。这提示,抗血管生成药物可能通过抑制IL-12b的表达,间接抑制NK细胞的免疫杀伤作用。8.临床研究发现,癌周肝脏组织内巨噬细胞浸润较多或巨噬细胞集落刺激因子表达较高的患者,接受根治性切除术后预后不佳。巨噬细胞和巨噬细胞集落刺激因子是独立预测患者死亡和复发的危险因素。9.潜在干预：如上结果提示,针对巨噬细胞的靶细胞的干预存在一定的治疗价值。药物干预增强巨噬细胞的抗肿瘤作用有望为抗血管生成药物增效,临床研究的结果甚至提示,即使单纯干预巨噬细胞的功能亦可能抑制肝癌转移。再者,多个报道显示唑来膦酸可通过促进巨噬细胞和DC的抗肿瘤免疫,我们前期的研究(Zhang, et al. Clin Cancer Res 2010)也提示唑来膦酸在免疫微环境方面与索拉非尼有协同作用。我们选取唑来膦酸为进一步的联合干预。动物实验发现,唑来膦酸可以逆转抗血管生成药物引起的脾脏il-12b表达下降。体外实验亦发现,唑来膦酸在特定浓度时可以逆转苏尼替尼对THP-1细胞的il-12b表达抑制作用。在抗血管生成药物预处理时,联用唑来膦酸可以抑制抗血管生成药物治疗对肝癌肺转移的促进。结论：抗血管生成治疗可以抑制机体,特别是巨噬细胞的IL-12b的表达,该作用介导抗血管生成治疗促进肝癌转移的潜能。针对其干预可有望成为抗血管生成药物的联合治疗或停药后的替代治疗,以期减少抗血管生成治疗的负面作用,提高疗效。应用价值1.以往研究抗血管生成治疗的促癌转移作用的机制,多用肿瘤细胞和肿瘤微环境的变化来解释；而本文发现药物可引起机体内环境变化,尤其是免疫力的变化,是更为关键的因素。这提示,患者在接受靶向VEGFR的抗血管生成治疗时,患者的机体免疫变化值得关注。2.首次筛选并验证了参与促癌转移作用的关键分子IL-12b,且巨噬细胞是其主要来源,以后者为靶细胞,发现临床可用的药物(唑来膦酸)可以逆转其功能,从而减少抗血管生成治疗的负面作用,提高其临床疗效。创新点1.以往有研究探索抗血管生成的促转移的负面作用,但多使用肿瘤细胞和肿瘤微环境的变化来解释该负面作用。本研究揭示了机体内环境在接受治疗时的变化,并阐述了机体的变化参与构成抗血管生成药物的促转移负面作用,丰富了抗血管生成治疗耐药的机制。2.筛选获得并验证了参与促成负面作用的关键分子IL-12b,并发现唑来膦酸可针对该分子进行干预,从而逆转抗血管生成治疗促转移的负面作用,探索其作为临床联合治疗或停药后的替代治疗的可行性。