大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaufmann and Gerdemann)隶属于卵菌门,其引起的大豆根腐病可导致每年10-20亿美元的直接经济损失,是威胁全世界大豆产业的毁灭性病害之一。由于大豆疫霉与大豆互作过程中分子机制尚不清楚,限制了防治手段的研究发展,因此深入研究大豆疫霉致病机理和大豆对大豆疫霉的免疫机制迫在眉睫。目前研究发现大豆疫霉在侵染大豆过程中分泌大量的效应蛋白对植物的免疫系统进行攻击,其中有一类庞大的蛋白家族被称为RXLR效应子,这类蛋白序列中在信号肽后含有一段保守的Arg-X-Lys-Arg(RXLR)序列特征。大豆疫霉基因组中编码了接近400个RXLR类效应子,本课题组前期研究发现RXLR效应子通过精确调控转录以互相协作的方式来抑制寄主的免疫反应,但这些效应蛋白如何调控寄主免疫的分子机制目前所知甚少。针对这一科学问题,本论文在实验室前期研究基础上以大豆疫霉侵染前期高量表达的效应蛋白Avh94作为研究对象,发现Avh94是一个在疫霉属中广泛存在的一个效应子,可以与植物的茉莉酸(JA)信号通路抑制因子JAZ蛋白发生互作,抑制植物的茉莉酸信号通路在侵染过程中的上调表达,从而抑制寄主的免疫,促进病原菌的侵染。另外,有研究表明大豆NB-LRR抗病基因主要受到miRNA的调节。本文针对大豆中调控大豆NB-LRR类抗病基因的miRNA展开研究,发现3个可以调控大豆中大量NB-LRR类抗病基因的miRNA,并发现了可以影响了大豆疫霉对大豆的致病力的miRNA。大豆疫霉效应子Avh94的功能分析。本研究发现大豆疫霉基因组中存在2个Avh94的拷贝,其中Avh94a大豆疫霉侵染大豆的初期被强烈诱导表达,在侵染3h左右表达量达到最大,而Avh94b在菌丝阶段和侵染阶段的表达水平比较低。Avh94在大豆疫霉四个生理小种中没有序列多态性;Phytophthora melonis、Phytophthora kernoviae、Phytophthora taxon totara、Phytophthora capsici、Phytophthora ramorum、Phytophthora infestans、Phytophthora parasitica 以及 Phytophthora cinnamomi 等卵菌病原菌中都发现了同源性蛋白,同源性与病原菌亲缘远近相关。Avh94在不同物种中的同源蛋白都可以抑制大豆疫霉PAMP蛋白XEG1诱发的细胞坏死。利用发根农杆菌在大豆毛状根中表达Avh94可以促进大豆疫霉对大豆的侵染。然而通过CRISPR/Cas9技术敲除大豆疫霉中的Avh94基因,不影响转化子生长速率,突变体的致病能力也没有显著变化。以上结果表明Avh94在大豆疫霉与寄主互作过程中具有毒性功能,但Avh94的毒性功能不是大豆疫霉侵染所必须的,很可能在大豆疫霉的基因组存在与Avh94功能冗余的基因。Avh94在寄主中分子靶标鉴定及干扰植物免疫反应机制。为了进一步解释Avh94抑制植物免疫反应的作用机制,我们通过酵母双杂交的方法在大豆cDNA文库中鉴定到其在大豆体内的互作蛋白JAZ蛋白。JAZ蛋白是植物茉莉酸信号通路中的阻遏蛋白,JAZ蛋白可以结合并抑制茉莉酸信号通路相关的转录因子的作用。在茉莉酸相关信号分子刺激时,JAZ蛋白会与COI1结合并经由26s蛋白酶体降解,从而JAZ蛋白结合转录因子被解除抑制,茉莉酸诱导相关基因开始表达。我们利用酵母双杂交、体外pull-down和双分子荧光互补的实验证明,Avh94与GmJAZl在体内体外发生互作。在烟草中过量表达GmJAZ1可以促进辣椒疫霉对烟草的侵染。另外,茉莉酸信号通路相关响应基因受到大豆疫霉侵染刺激早期上调表达,说明茉莉酸信号通路是响应疫霉早期侵染的响应信号。根据Avh94的序列特征进行截短突变发现,Avh94的N端包含RXLR的区域是互作的关键区域,另外我们发现Avrla、Avrlc和Avh23也可以和GmJAZ1在酵母中发生互作。根据GmJAZ1的功能域特征采用逐段突变的方法,我们鉴定到GmJAZ1的Jas domain是Avh94与GmJAZl的互作关键区域,Jas domain也是JAZ蛋白和MYC2和COI1互作的关键区域。拟南芥基因组中编码了 12个JAZ蛋白,利用体外pull-down验证发现Avh94可以和除了 AtJAZl以外的所有的JAZ蛋白互作。在拟南芥中表达Avh94可以促进辣椒疫霉对拟南芥的侵染。利用丁香假单胞菌对表达Avh94的拟南芥进行侵染诱导发现,Avh94可以显著抑制JA信号通路基因AtJAZ9的表达,同样在大豆毛状根中过量表达Avh94也可以显著抑制JA信号通路基因GmVSPa与GmPR3的表达。综上所述,Avh94通过抑制了茉莉酸相关信号基因促进促进病原菌的侵染,但目前尚不清楚这与JAZ的互作是否相关。miRNA调控大豆抗病相关基因并介导对大豆疫霉的抗性研究。大豆中有若干个miRNA预测可以直接靶向抗病相关基因,其中miR1507c-3p、miR1510a/b-3p和miR2109-5p、miR2118a/b-3p共可以靶向超过100个NB-LRR类基因。本研究在大豆毛状根中利用短串联靶标模拟(shorttandemtargetsmimic,STTM)、MIR基因过表达等方法对若干个miRNA沉默或过表达miRNA,对沉默和过表达miRNA的样品进行sRNA-seq 发现 miR1507c-3p、miR151)a/b-3p、miR2109-5p 是调控大豆NB-LRR基因的三个重要miRNA。sRNA-seq结果发现这三个miRNA均可以直接靶向超过35个NB-LRR基因,沉默及过表达miRNA的样品中,其靶向的NB-LRR基因诱导产生的次级小干扰RNA的含量显著下调或上调。在大豆疫霉侵染过程中miR1510a/b-3p表达积累量明显降低。在大豆毛状根中沉默miR1510a/b-3p可以促进大豆疫霉侵染。然而沉默miR1510a/b-3p并不会明显改变NB-LRR基因转录本的丰度,同样但这些以上结果表明miR1510a/b-3p是一个参与调控大豆对大豆疫霉侵染的重要miRNA,这种调控可能与其靶向NB-LRR基因并诱导产生的次级小干扰RNA相关。植物cyclophilin蛋白与多个RXLR效应子互作。Cyclophilin属于一类在生物体中普遍存在并具有多种生物活性的蛋白,具有肽脯氨酰顺反异构酶(prolyl-peptidyl isomerase,PPIase)的活性。这类蛋白的肽基脯氨酸顺反异构酶活性可以作用于底物蛋白并改变其空间构象。已有研究报道病原菌效应蛋白可以利用植物中cyclophilin的酶活而被激活。在利用酵母双杂交筛选大豆疫霉RXLR效应子的大豆互作蛋白时发现Avr3b、Avrlk和Avh23的互作候选蛋白中都有cyclophilin的存在。通过一对一互作验证发现,这几个效应子可以在酵母体内与GmCYPl发生互作。已有研究发现在cyclophilin蛋白与效应蛋白互作时,Glycine-Proline-Any-Leucine(GPxL)基序是互作的关键区域,其中GP基序通常是cyclophilin蛋白与其底物的作用位点。通过序列比对发现这Avr3b、Avrlk和Avh23均包含了 GPxL序列或关键的GP序列。进一步的对大豆疫霉的380个RXLR效应子序列进行分析发现,6个效应子含有标准的GPxL基序,以及包括Avh94在内的72个效应子含有GP基序。这些含有GPxL或者GP基序的效应子是cyclophilin的潜在互作对象,在侵染过程中可能利用植物cyclophilin的酶活性来激活自身功能。综上所述,本研究揭示了大豆疫霉通过招募植物cyclophilin蛋白激活效应子功能的潜在重要机制。