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水稻纹枯病菌是世界性的水稻重要病害,同时也是我国水稻三大病害之一。目前其基因组研究较少,限制了许多研究工作的开展。本研究构建了第一个稻立枯丝核菌丝AG1 IA fosmid基因文库。利用Illumina GA II技术对水稻立枯丝核菌AG1 IA的基因组DNA以及线粒体DNA(mtDNA)进行测序,并对mtDNA的测序结果进行拼接,得到一个完整的线粒体基因组序列,对其上的基因进行组装,预测,并对物种间线粒体基因的进化特点和系统演化进行分析。主要结果如下:
1、水稻纹枯病AG1 IA Fosmid基因组文库的构建和鉴定本研究在构建之前已经在进行水稻丝核菌AG1 IA全基因组测序,基因组大小为36.4Mb。从水稻立枯丝核菌AG1 IA提取基因组DNA,选取大小合适的DNA片段用低熔点琼脂糖回收,后进行末端修饰,再以Fosmid质粒作为载体,构建了水稻立枯丝核菌AG1 IA fosmid基因组文库。该文库包含有5000个克隆,重组率为100％;随机挑去16个克隆进行培养、NotI酶切、脉冲电泳检测插入片段长度分布在35～45kb之间,平均为35kb,覆盖率为水稻立枯丝核菌丝AG1 IA基因组的4.81倍,从文库中筛选得到单拷贝DNA序列的概率为97％。从16个单克隆中挑去8个克隆进行末端测序,其中一个未测出,对末端进行比对,均为菌类相关序列。水稻立枯丝核菌AG1 IA fosmid基因组文库的构建,为今后该物种基因组的研究工作奠定了基础,为开展分子标记发掘、功能基因筛选与定位、遗传图谱、物理图谱的构建等研究工作提供了有效的工具。
2.水稻纹枯病AG1 IA mtDNA的提取以及拼接组装。
1)利用常规碱裂解法(SDS法)方法加酶解法(DNAse),超速离心分离得到了水稻纹枯病AG1 IA的mtDNA;
2)在NT Database数据库Blast比对鉴定线粒体基因。用SOAPdenovo软件拼接组装线粒体基因,得到一个有28个缺口、全长146kb的线粒体基因组,根据每个缺口上游端和下游端已知的序列设计引物进行PCR扩增填补。最终,我们得到一个全长146,118bp的线粒体全基因组序列。
3.水稻纹枯病AG1 IA mtDNA的分析我们获得T21个与线粒体基因非常相似的开放阅读框(ORFs)。找到了线粒体上一些非常保守的基因如:COX1、COX2、ATP6。在整个预测过程中,利用BLASTX从Swiss-Prot database数据库鉴定候选同源基因。用exonerate多序列比对软件对氨基酸序列进行分析,在Swiss-Prot proteins数据库对这些序列进行比对得到这些有用的开放阅读框(ORFs)。从已知的DNA序列中,我们通过Rfam v9.1鉴定出了1个tRNA基因,1个核糖体RNA基因、4个核酶基因,使用tRNAscan-SE鉴定出了另外25个tRNA基因。
1)全序列以及结构分析:通过线粒体测序,得到其全基因组全长为146,118kb,GC含量为33.8％。包含26个tRNA基因、15个蛋白质编码基因、1个核糖体基因、4个核酶基因。
2)tRNA组成以及二级结构分析:水稻立枯丝核菌丝AG1 IA mtDNA包含26个tRNA基因,tRNA-Thr和tRNA-Arg各有2个,tRNA-Met是3个,还有两个不知功能的tRNA-Under。其他17种氨基酸都只有一个tRNA,绘制了各种tRNA基因的二级结构。
3)蛋白质编码基因的分析:预测共编码有21种蛋白质多肽,包括21个蛋白基因(ATP6、ATP8、ND1、ND3、ND4、ND5、ND6、ND6、COX1、COX2、COX3、Cytb、Cyb、B11、B11、B12、IAmt2、IAmt6、IAmt7、IAmt8、IAmt18)3.水稻立枯丝核菌AG1 IA线粒体基因组进化分析。
对AG1 IA的线粒体ATP6基因和Cytb基因以及从NCBI/GenBank中各真菌的对应基因进行同源性比对,构建了ATP6基因和Cytb基因的系统进化树,为水稻丝核菌的分类鉴定提供参考。