目的:测定药物过敏性休克死亡者右心血、心包液、胸腔液及腹腔液中肥大细胞羧肽酶A3、类胰蛋白酶及类糜蛋白酶的含量;观察类胰蛋白酶、类糜蛋白酶在药物过敏性休克死亡者心、肺、咽喉、胃及空肠组织中的表达;试图为药物过敏性休克死亡的法医学诊断提供客观的实验室诊断指标及检测方法。方法:方法:实验设立药物过敏性休克死亡组、冠心病猝死组及对照组三组。药物过敏性休克死亡组20例,死因确诊为药物过敏性休克死亡,并排除其生前存在冠心病、肥大细胞增多症、颅脑损伤及吸食毒品;过敏性休克的原因分别为静脉滴注青霉素2例、头孢曲松钠6例、左氧氟沙星5例、盐酸林可霉素1例、赖氨匹林1例、洛美沙星1例、中药清开灵1例,中药双黄连1例,口服布洛芬1例,水合氯醛灌肠1例;20例中5例在死后48h内进行了尸体解剖检验,14例在死后7d内进行了尸体解剖检验,1例在死后15d尸体解剖。冠心病猝死组20例,死因确诊为冠状动脉性猝死,并排除生前为过敏体质者、肥大细胞增多症患者及毒品吸食者,其中10例在死后48h内进行了尸体解剖检验,10例在死后7d内进行了尸体解剖检验。对照组20例,排除过敏性休克、颅脑损伤、冠心病及吸食毒品导致的死亡,并排除生前为过敏体质者及肥大细胞增多症患者,20例均在死亡后48h内做了系统尸体解剖。以上实验组在进行尸体解剖检验时均采取尸体右心血、心包液、胸腔液和腹腔液,离心后取上清,-80℃冷冻保存,以备荧光酶联免疫(FEIA)和酶联免疫吸附(ELISA)检测;提取心脏、肺脏、咽喉、胃及空肠组织,甲醛固定并石蜡包埋,以备进行免疫荧光染色;提取心脏、肺脏、咽喉、胃及空肠组织并进行蛋白提取,以备进行western blot检测。(1)ELISA双抗体夹心法测定右心血、心包液、胸腔液及腹腔液中肥大细胞羧肽酶A3和类糜蛋白酶的含量;(2)FEIA法测定右心血、心包液、胸腔液及腹腔液中肥大细胞类胰蛋白酶含量;(3)免疫荧光染色法对心、肺、咽喉、胃和空肠组织中类胰蛋白酶和类糜蛋白酶进行染色,Olympus BX61荧光显微镜观察并进行图像采集,Image-pro plus6.2软件进行图像分析;(4)western blot法检测心、肺、咽、胃和空肠器组织中类胰蛋白酶含量;(5)应用3种甲苯胺蓝异染肥大细胞的方法,观察药物过敏性休克死亡组肥大细胞脱颗粒现象;(6)SPSS17.0统计软件对实验数据进行统计分析,组间差异采用单因素方差分析(ANOVA)进行检验,两两检验采用LSD法进行校正。结果:结果:药物过敏性休克死亡组右心血、心包液、胸腔液及腹腔液肥大细胞羧肽酶A3含量分别为10.13±2.11ng/ml、4.34±1.61ng/ml、4.60±1.81ng/ml、4.49±1.21ng/ml,类胰蛋白酶含量分别为41.57±5.48ug/l、28.96±4.82ug/l、29.71±4.90ug/l、22.62±4.10ug/l,类糜蛋白酶含量分别为7.85±1.46ng/ml、7.31±1.37ng/ml、7.32±1.79ng/ml、7.29±1.53ng/ml。冠心病猝死组右心血、心包液、胸腔液及腹腔液肥大细胞羧肽酶A3含量分别为4.51±0.91ng/ml、2.07±0.41ng/ml、1.85±0.61ng/ml、1.89±0.66ng/ml,类胰蛋白酶含量分别为16.42±2.91ug/l、11.55±2.41ug/l、12.74±2.84ug/l、10.66±2.76ug/l,类糜蛋白酶含量分别为3.02±0.86ng/ml、2.80±0.67ng/ml、2.82±0.76ng/ml、2.79±0.76ng/ml。对照组右心血、心包液、胸腔液及腹腔液肥大细胞羧肽酶A3含量分别为3.18±1.30ng/ml、1.36±0.48ng/ml、1.26±0.36ng/ml、1.59±0.51ng/ml,类胰蛋白酶含量分别为4.86±0.86ug/l、4.64±0.95ug/l、3.30±0.84ug/l、3.11±0.96ug/l,类糜蛋白酶含量为1.22±0.55ng/ml、1.13±0.48ng/ml、1.15±0.58ng/ml、1.11±0.49ng/ml。药物过敏性休克死亡组右心血、心包液、胸腔液及腹腔液中肥大细胞羧肽酶A3、类胰蛋白酶、类糜蛋白酶含量与冠心病猝死组及对照组相比,显著升高(P<0.05),其中尤以右心血含量升高最为明显;药物过敏性休克死亡组心脏、肺脏、喉、胃及空肠组织组织中类胰蛋白酶及类糜蛋白酶表达均明显高于冠心病猝死组及对照组(P<0.05)。冠心病猝死组右心血及心包液肥大细胞羧肽酶A3、类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量与对照组相比显著升高(P<0.05),但其含量显著低于药物过敏性休克死亡组(P<0.05),胸腔液和腹腔液中肥大细胞羧肽酶A3、类胰蛋白酶、类糜蛋白酶与对照组相比,无明显差异(P>0.05);冠心病猝死组心脏组织中类胰蛋白酶及类糜蛋白酶表达明显高于对照组(P<0.05),肺脏、喉、胃及空肠组织中类胰蛋白酶及类糜蛋白酶表达与对照组相比,无明显差异(P>0.05)。结论:结论:(1)FEIA法、ELISA双抗体夹心法测定尸体右心血、心包液、腹腔液及胸腔液中羧肽酶A3、类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量,可作为药物过敏性休克死亡法医学鉴定的依据;(2)无法获得心血、心包液、胸腔液及腹腔液或尸体腐败的案例,western blot法、免疫荧光染色法检测心脏、肺脏、喉、胃及空肠组织中类胰蛋白酶和类糜蛋白酶的表达,可应用于药物过敏性休克死亡的法医学鉴定。(3)药物过敏性休克死亡者右心血、心包液、胸腔液及腹腔液中肥大细胞羧肽酶A3、类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量高低与其用药后发敏时间、过敏后存活时间有关,且受死亡后保存条件及保存时间长短的影响;(4)药物过敏性休克死亡者脏器组织中类胰蛋白酶及类糜蛋白酶表达多或少与用药后发敏时间、过敏后存活时间及不同的靶向器官有关;与体液相比其受死亡后保存条件及保存时间长短的影响相对较小。(5)药物过敏性休克死亡的机制复杂,加之鉴定过程中存在死后自溶、凝血及溶血,药物过敏性休克死亡的实验室诊断指标的准确性、灵敏度受到一定的影响,因此法医学诊断非常困难;涉及药物过敏性休克死亡法医学鉴定应尽可能多指标、多组织脏器(或体液)以及多种方法共同检测、综合分析。