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中介蝮(Gloydius intermedius)为蝰科蝮亚科毒蛇,广泛分布于我国西北和华北地区,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种蝮蛇。蛇毒磷脂酶A2(Snake venom phospholipase A2, svPLA2)是蛇毒液中毒性最强的组分之一,除酶活性外,还表现出多种毒理药理学活性,具有潜在的利用价值。但是,关于中介蝮蛇毒PLA2神经毒素的结构与功能的关系、作用机理等有待阐明,本研究分离了其主要神经毒素,并在此基础上对其神经-肌肉的阻断效应进行了初步探究。本论文的研究内容1.中介蝮蛇毒PLA2的分离纯化(1)凝胶过滤层析利用凝胶过滤填料Sephacryl-200HR对中介蝮粗毒进行初步分离,缓冲液为50mM碳酸氢铵(pH8.0),流速0.3mL/min,收集5个峰(P1-P5),12%SDS-PAGE检测纯度,并测定其PLA2酶活性及小鼠致死效应。(2)反相高效液相和质谱分析利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离凝胶过滤层析得到的P3组分,对有PLA2活性的组分做质谱分析,将其序列与中介蝮毒腺cDNA文库中PLA2基因编码的氨基酸序列对应起来,进行生物信息学分析。2. Gintexin对神经肌肉接头的效应(1)神经肌肉接头的阻断效应分别取大鼠膈神经膈肌标本和小鸡颈二腹肌标本,固定于浴槽中,给0.5g预张力神经刺激(6V、0.9Hz、0.2ms)至少平衡15min,分别用40mM KCl和55μMACh检测标本性能是否良好,随后加入不同终浓度的Gintexin(2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL),待收缩完全抑制后再分别加40mM KCl和ACh观察标本的肌肉完整性和突触后膜上乙酰胆碱受体是否收到影响,并记录肌肉收缩张力。(2)免疫组化对作用位点的确定将神经肌肉接头阻断效应实验中使用的大鼠膈神经膈肌标本和小鸡颈二腹肌标本置于10%甲醛溶液中固定24h,经常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、连续切片(厚度3μm),为白片,随后进行脱蜡、内源性HRP灭活、抗原修复、血清封闭、一抗4℃过夜(兔抗PLA2、SNAP25,分别用PBS缓冲液1：1000及1：100稀释),次日,加HRP标记二抗,DAB显色,核复染,观察PLA2。3.肌肉损伤效应(1)组织化学将上述神经-肌肉标本切片脱蜡,分别进行HE染色和Masson染色,观察肌细胞和结缔组织的损伤情况。(2)肌酸激酶的测定将体重18-20g的昆明小鼠分组,分别在小鼠腓肠肌注射粗毒(8μg在50μL生理盐水中)和Gintexin(1.5μg在50μL生理盐水中),另取3只昆明小鼠注射50gL等量生理盐水作为对照；在不同时间点(1h、3h、6h、9h、12h、24h)用摘眼球的方式取血,随后10000rpm离心10min,取上清即为血清样品,采用全自动生化分析仪进行肌酸激酶的测定；分析结果。研究结果：(1)凝胶过滤层析从中介蝮粗毒中共分5个蛋白峰(P1-P5),P3组分具有PLA2酶活性最高,并有小鼠致死毒性。(2)用RP-HPLC分析发现：P3组分含有多种PLA2组分,将其氨基酸序列与中介蝮PLA2基因(86个克隆)cDNA编码的氨基酸序列对照发现,P3主要组分是Gintexin-A、Gintexin-B、Gin-E6b及少量的Gin-E6a,且Gintexin-A、Gintexin-B含量最多,可以达到65%。质谱结果表明,Gintexin-A分子量为9847Da, GintexinB分子量为14177Da,Gin-E6b分子量为13662Da,Gin-E6a为14074Da。氨基酸序列比对后可以判断出Gintexin同响尾蛇毒素Crotoxin-样,是由Gintexin-A和Gintexin-B通过非共价键结合的异型二聚体,所以可以用P3组分来研究Gintexin的毒理作用。(3)大鼠膈神经-膈肌和小鸡颈二腹肌的离体实验证明,小鸡颈二腹肌标本对Gintexin更加敏感,终浓度2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL的Gintexin完全阻断小鸡颈二腹肌标本神经传导的时间分别是49±0.8min(n=3),40±0.7min(n=3)、30±0.8min(n=3),但对突触后膜乙酰胆碱受体并没有影响。(4)免疫组化结果显示,Gintexin作用位点并非是神经纤维,而是神经肌肉接头处,由此可以判断,本研究分离的毒素作用的具体部位是神经突触,与离体实验的结果相结合可以确定,该毒素为突触前神经毒素。(5)通过组织化学的HE染色、Masson染色结果表明,肌细胞出现了一定的损伤效应,而且损伤作用比粗毒弱,而对肌细胞外及神经元外的结缔组织没有影响。(6)测定粗毒(8μg)和Gintexin(1.5μg)后不同时间点的血清CK活性,结果表明粗毒在注射3小时后CK活性最高,Gintexin组在3～6小时时CK活性都很高。结论：采用凝胶过滤层析和反相高效液相(RP-PHLC)技术,成功地从中介蝮蛇粗毒中分离纯化得到磷脂酶A2神经毒素,主要组分是由Gintexin-A和Gintexin-B构成的一种异二聚体复合物Gintexin,属于一种突触前神经毒素,具有一定的肌肉毒性。本工作为进一步研究中介蝮磷脂酶A2神经毒素的分子进化及作用机理奠定了理论基础。