论文部分内容阅读
第一部分芳香烃受体通过介导克罗恩病患者外周血Thl7/Treg细胞比例的异常改变参与肠道炎症形成[背景]克罗恩病（Crohn’s disease,CD）是一种肠道慢性肉芽肿性炎,为炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）的主要临床表型之一。该病发病机制尚不完全明确,目前认为遗传、环境、微生物和免疫因素的共同作用参与了 CD的发生与发展,尤其免疫因素在CD的发病中起关键性作用,其中Th17/Treg细胞失衡学说成为近年来研究热点。国内外研究表明调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）是一种具有抑制效应性T细胞增殖和活化功能的细胞亚群,能够减轻IBD患者的肠道炎症。辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）在IBD中的作用仍存在争议,有研究显示Th17细胞通过释放炎症因子介导肠道炎症,相反也有研究提示Th17细胞对肠粘膜有一定的保护作用。芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AhR）是一种能被特异配体激活的转录因子,在宿主体内接受外界环境刺激,介导黏膜免疫在炎症中发挥了重要作用。动物研究表明AhR是调控Th17及Treg细胞分化的重要因子,可调控Th17/Treg细胞相关免疫,参与自身免疫性疾病的发生。并且有研究证实CD患者病变肠组织中AhR表达减低,AhR缺失可导致叉头蛋白3-T细胞转录因子（forkhead box P3,Foxp3）表达减低而维甲酸相关孤儿核受体γt（retinoic acid receptor-related orphan nuclear receptor garmma,RORγt）表达增加,Foxp3、RORyt分别是Treg、Th17细胞增殖分化的重要转录因子。因此本研究旨在初步探讨AhR是否通过调控Foxp3、RORyt进而调控Treg、Th17细胞参与克罗恩病肠道炎症形成。[目的]通过检测CD患者及正常对照组肠组织中AhR、Foxp3、RORyt蛋白表达水平,检测外周血Treg、Th17细胞比例及血清炎性生物学指标包括血沉（ESR）、血清C-反应蛋白（CRP）水平、血小板（PLT）计数、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）来探讨AhR是否通过调控Foxp3、RORγt进而调控Treg、Th17细胞参与克罗恩病肠道炎症形成及其临床意义。[方法]1.纳入2016年2月至2017年5月在南京医科大学第一附属医院消化科收治的CD患者进行Treg细胞比例检测,同期病房收治的12例消化道息肉治疗后复查者作为正常对照。2.临床疾病活动度评估:CD活动度的评估采用克罗恩病疾病活动指数（CDAI）,总分<150为缓解期,≥150为活动期,其中150-220为轻度,221-450为中度,>450为重度。3.Western blot检测肠组织中AhR、Foxp3、RORyt蛋白表达水平。4.流式细胞仪检测外周血Treg、Th17细胞比例。5.血细胞仪检测PLT计数、MPV和PDW;魏氏法检测ESR;免疫比浊法检测血清CRP水平。[结果]1.与缓解期CD患者相比,中度活动期CD患者血清ESR水平明显升高,而轻度活动期CD患者血清ESR水平虽升高,但差异无统计学意义。轻、中度活动期CD患者血清CRP水平较缓解期均明显升高。轻度活动期CD患者的PLT计数较缓解期及对照组均明显升高。进一步分析轻度活动期CD患者的平均血小板体积（MPV）,发现MPV较缓解期降低。轻、中度活动期CD患者的血小板分布宽度（PDW）较对照组降低,但差异无统计学意义。2.较正常对照组相比,CD患者的肠组织中AhR蛋白表达下调,ROR yt表达上调,Foxp3表达下调。3.采用流式细胞技术对纳入研究的轻度和中度活动期CD、缓解期CD患者及正常对照组外周血Treg细胞比例进行测定,发现轻、中度活动期CD患者外周血Treg细胞占CD4+细胞比例较CD缓解期及对照组显著降低。4.应用流式细胞技术对纳入的41例CD患者中的17例（活动期6例,缓解期11例）检测Th17细胞比例,发现活动期CD患者外周血Th17细胞比例高于缓解期CD。5.采用Pearson相关性分析,结果显示CD患者外周血中Treg细胞比例与CDAI评分呈负相关,而与患者MPV呈正相关,采用Spearman相关性分析,结果显示CD患者外周血中Treg细胞比例与ESR及血清CRP水平呈负相关。[结论]CD患者肠组织中AhR蛋白表达下调,RORγt表达上调,Foxp3表达下调,外周血Th17细胞增多,Treg细胞减少以及Treg细胞比例减低与反映CD疾病活动的血清炎性生物学指标ESR、血清CRP水平呈负相关,提示AhR可能是通过调控Foxp3、RORyt进而调控Treg、Th17细胞参与克罗恩病肠道炎症形成。第二部分芳香烃受体通过介导肠固有淋巴细胞ILC3/ILC1异常改变参与肠道炎症形成[背景]克罗恩病（Crohn’s disease,CD）是一种肠道慢性肉芽肿性炎。该病发病机制尚不完全明确,目前认为遗传、环境、微生物和免疫因素的共同作用参与CD的发生与发展,尤其免疫因素在CD的发病中起关键性作用,最新研究发现固有淋巴细胞（innate lymphoid cells,ILCs）在介导肠粘膜免疫紊乱,参与CD患者肠道炎症的发生与发展中具有重要作用。固有淋巴细胞是近年来发现的一类天然免疫细胞,根据分泌细胞因子的不同及其生长分化需要不同的转录因子,分为3个亚群:Group 1 ILCs（ILCls）,group 2 ILCs（ILC2s）及group 3 ILCs（ILC3s）,可作为免疫反应的早期参与者。正常肠道组织中以ILC3为主,其作为免疫效应细胞,通过产生IL-22促进上皮细胞增殖与损伤后黏膜愈合、保持黏膜屏障的完整性,维持肠道稳态,ILC1细胞较少。多项研究提示结肠炎模型鼠肠黏膜组织中通过分泌IFN-y对结肠炎鼠的肠道炎症有破坏作用的ILC1增加,通过产生IL-22对结肠炎鼠的肠道炎症损伤具有保护作用的ILC3减少。近年来研究者发现活动期CD患者病变肠组织中也存在具有分泌IFN-y功能的ILC1细胞数量增加,产生IL-22的ILC3细胞数量减少的现象。芳香烃受体（Aryl hydrocarbon receptor,AhR）是一种能被特异配体激活的转录因子,在宿主体内接受外界环境刺激,介导黏膜免疫在炎症中发挥了重要作用。近期国外学者研究表明AhR是调控RORyt+ILCs细胞分化的重要转录因子,AhR的缺失将导致RORyt+ILC凋亡增加以及分泌IL-22减少。有研究表明CD患者病变肠组织中AhR表达减低,尤其是在CD4阳性T淋巴细胞及自然杀伤细胞中明显减低。但AhR是否能够通过调控肠固有淋巴细胞ILC3/ILC1间异常改\变介导克罗恩病形成的机制尚不清楚。因此本研究旨在初步探讨AhR是否通过调控肠固有淋巴细胞ILC3/ILC1间异常改变介导CD的肠道炎症发生与发展。[目的]通过检测CD患者及正常对照组肠组织中AhR蛋白表达水平;ILC3/ILC1细胞的分布;以及以AhR敲基因鼠为研究载体,通过对野生型及AhR+鼠进行TNBS造模,观察野生型及AhRi鼠肠道炎症情况,并检测肠组织中ILC3/ILC1细胞的分布,从而探讨AhR是否通过介导肠固有淋巴细胞ILC3/ILC1异常改变参与肠道炎症形成及其临床意义。[方法]1.免疫荧光双标记法检测CD患者及正常对照者病变肠组织中ILC3/ILC1细胞的分布。2.Western bolt检测CD患者及正常对照者病变肠组织中AhR蛋白表达水平。3.以AhR敲基因鼠为研究载体,通过对野生型及AhR7鼠进行TNBS造模,观察AhR缺失对肠道炎症的影响,同时采用免疫荧光双标记法检测野生型及AhR+鼠肠组织中ILC3/ILC1细胞的分布。[结果]1.与正常对照组相比,活动期CD患者肠粘膜层及粘膜下固有层中ILC1细胞数量明显增多,ILC3细胞数量明显减少。2.与正常对照者相比,活动期CD患者肠组织中AhR蛋白表达量显著下降。3.与野生型小鼠TNBS造模后相比,AhRv小鼠TNBS造模后结肠炎症明显加重,HE染色后镜下特点:炎症细胞几乎浸润肠粘膜全层,上皮结构破坏、隐窝结构消失。4.与野生型TNBS造模小鼠相比,AhR^+TNBS造模鼠病变肠组织中ILC1细胞数量明显增多,ILC3细胞数量明显减少。[结论]活动期CD患者肠粘膜层及粘膜下固有层中ILC1细胞数明显增多,ILC3细胞数明显减少,同时活动期CD患者肠组织中AhR蛋白表达量显著下降;与野生型TNBS造模小鼠相比,^/鼠TNBS造模肠道炎症重,病变肠组织中ILC1细胞明显增多,ILC3细胞显著减少。